酶底物法与多管发酵法和纸片法测定水中粪大肠菌群方法比较

粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，又称耐热大肠菌群。生长于人与部分动物体内肠道中，水体中的粪大肠菌群主要来自粪便污染，因此通过测定水中粪大肠菌群的含量，可间接得出水体受粪便污染的情况，在环境监测和卫生防疫方面具有重要意义

本文对比三种不同粪大肠菌群的检测方法，通过比较多管发酵法、纸片快速法和酶底物法的检测结果，讨论酶底物法检测粪大肠菌群的可行性及应用。

　　一、检测方法及原理

　　1、多管发酵法

　　将水样接种于乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，在37±0.5℃下培养24±2 h进行初发酵试验，大肠菌群生长繁殖产酸产气，产酸使乳糖蛋白胨培养液中的p H降低，发酵管由紫色变黄色;产气使发酵管中导管产生小气泡，产酸或产气则为阳性，否则为阴性。

　　将显阳性的发酵管接种至EC培养液，在44.5±0.5℃下培养24±2 h进行复发酵，造成不利于自然环境中的大肠杆菌生长的条件，而粪大肠菌群将会在44.5℃下继续存活生长繁殖，由此通过复发酵管中产气情况判定阳性。

　　通过复发酵后显阳性的发酵管数，查询MPN表，通过统计学方法计算出粪大肠菌群浓度。

　　2、纸片快速法

　　通过将水样接种于吸附了溴甲酚紫和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在44.5±0.5℃下培养18～24 h，当粪大肠菌繁殖产酸使溴甲酚紫变黄色，产气使相应的脱氢酶催化底物TTC形成红色的不溶性三苯甲臢 (TTF) ，在黄色背景显示出红色的斑点或红晕，判定粪大肠菌群存在，该接种纸片显阳性，通过查询MPN表计算出相应浓度值。

　　3、酶底物法

　　将已加入培养基的水样混匀与97孔定量盘，置于44.5±0.5℃培养24h，粪大肠菌能在该温度产生β-半乳糖苷酶 (β-D-galactosidase) ，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖 (ONPG) 生成黄色的邻硝基苯酚，通过定量盘大小孔显黄色数查询酶底物法的MPN表，计算出粪大肠菌群的浓度。

　　二、实验步骤

　　根据水样污染程度选择不同的稀释倍数，将水样接种于乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，在37±0.5℃下培养24±2 h进行初发酵试验，产酸产气显阳性;将显阳性的发酵管用3 mm接种环接种至EC培养液，在44.5±0.5℃下培养24±2 h进行复发酵，发酵管内小导管有气泡则显阳性，记录阳性管数，查对应MPN表，计算结果。

　　1、纸片快速法

　　根据水样污染程度，样品按照三个10倍递减的不同接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15张纸片。接种水样应均匀滴加在纸片上，纸片充分浸润、吸收水样，用手在聚丙烯塑膜袋外侧轻轻抚平，做好标记。接种后立即放置44.5±0.5℃的培养箱中培养18～24 h后，通过纸片上颜色变化判定阳性纸片数，查询对应MPN表，计算结果。

　　2、酶底物法

　　根据水样受污染程度，进行样品稀释，将商品化酶底物培养基加入100 ml待测样品中，充分混匀，完全溶解后全部倒入97孔定量盘中，抚平定量盘背面，赶出气泡，用程控定量封口机封口。放置于44.5±0.5℃的培养箱中培养24 h后于标准阳性比色盘对比，根据阳性孔数查询对应的MPN表，计算结果。

　　三、结果与讨论

　　1、实验结果与数据分析

　　实验开始前对使用的玻璃器皿按要求进行灭菌操作，制备无菌水时检验纯水质量并进行灭菌操作，并开启实验室紫外灯对细菌室灭菌2 h以上。

　　根据方法标准和《水和废水监测分析方法 (第四版) 》要求，分别用灭菌水对每批次样品培养基 (培养纸片) 进行全程序空白和实验室空白检验，均未检出，亦无任何颜色或气泡等明显变化。

　　每次实验均用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌做阳性、阴性对照，且大肠埃希氏菌对照组样品均显阳性，产气肠杆菌对照组均显阴性。