天木生物MMC成功助力高产酪氨酸大肠杆菌的选育

       本期为您推荐江南大学未来食品科学中心副主任周景文教授团队发表在Synthetic and Systems Biotechnology上面的一篇文章：Synergetic engineering of Escherichia coli for efficient production of L-tyrosine。本研究通过协同工程策略，针对莽草酸途径并微调代谢过程，并利用实验室适应性进化（MMC）提高菌株对酸性条件的耐受性，最终获得了一株优化的菌株，在5升发酵罐中62小时内能够产生92.5 g/L的L-酪氨酸，对L-酪氨酸的工业化生产有着重要的意义。

       L-酪氨酸在食品、饲料、化工和制药行业中具有广泛的应用，它不仅是多种天然产物的前体，如咖啡酸、类黄酮和姜黄素等，还涉及治疗帕金森综合症的药物L-DOPA的合成。尽管L-酪氨酸具有重要的工业价值，传统化学合成或者酶促法生产酪氨酸的工艺存在成本高和稳定性差的缺点。微生物发酵法产酪氨酸具有成本低，操作简单等优势，但是也存在产量较低，高密度发酵菌株不够稳定等缺点。

       研究人员以大肠杆菌WSH-Z06作为起始菌株，对莽草酸和芳香氨基酸积累相关的几个基因进行过表达和敲除混合验证，得到一株联合4个基因过表达与3个基因敲除的菌株，48 h摇瓶L-酪氨酸产量达到4.22 g/L（图2 ）。接着在其莽草酸途径中添加磷酸解酮酶途径（PK），发现菌株在摇瓶中的OD600提升了9.8%，但是整体的L-酪氨酸产量呈现降低趋势。整合2个NADH与NADPH互相转化的基因后，得到的菌株产量提升至6.17g/L（图3a）。将该菌株进行5L发酵罐水平的发酵，L-酪氨酸的产量达到50.2 g/L，同时在发酵液中检测到12.4 g/L的乙酸（图3b），高浓度乙酸导致了菌体生长被明显抑制（图3b）。

       为了减少乙酸的累积，对大肠杆菌乙酸生产途径基因进行敲除，得到的菌株乙酸产量下降33.6%，菌体生长略有改善。进一步提升其对乙酸的耐受性，提高赖氨酸产率，利用MMC（微生物液滴连续传代进化仪）进行适应性进化，在液滴体系下对超过200个液滴进行50次传代筛选，不断提高乙酸浓度，得到在pH 5.1下生长良好的菌株，最优摇瓶水平产量为7.11 g/L（图4）。通过在5L发酵罐中控制葡萄糖浓度与溶氧，最终L-酪氨酸产量达到92.8 g/L。

       这一系列综合的工程策略显著推进了L-酪氨酸在微生物合成中的产量，为工业级生产提供了有力的实验支持。

图1 葡萄糖生物合成L-酪氨酸途径

图2 敲除和过量表达基因后赖氨酸的产量

图3 优化菌株摇瓶与5L发酵罐发酵结果

图4 大肠杆菌乙酸体系改性及耐酸性进化

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.10.005