天木生物ARTP成功助力叶绿素缺陷型小球藻的选育

天木生物ARTP成功助力叶绿素缺陷型小球藻的选育

本期为您推荐华南理工大学魏东教授团队发表在Bioresource Technology上的一篇文章：Breeding a novel chlorophyll-deficient mutant of Auxenochlorella pyrenoidosa for high-quality protein production by atmospheric room temperature plasma mutagenesis。本研究采用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)，以蛋白核小球藻为原始菌株，通过多轮ARTP诱变和筛选，培育出蛋白质含量、质量和产量较高的叶绿素缺乏突变体，这样的微藻在生产未来食品蛋白的方面具有应用潜力。

近年来，随着更多的人关注环境保护与健康饮食，人们开始寻找除动物肉以外的替代蛋白质。其中，微藻被认为是一种可替代的蛋白质来源，特别是螺旋藻和小球藻相较于传统蛋白质如肉、蛋、大豆、牛奶，有着更高的蛋白质含量。除此之外，微藻还含有多种营养物质，如多糖、多不饱和脂肪酸和维生素。此外，它们的生长周期短，不会与传统作物争夺水和空间。尽管微藻具有很多优势，但是由于他们颜色以及令人不舒服的气味，目前它们的使用仅限于含有微藻粉的健康食品。这是因为微藻内叶绿素含量高，具有强烈的绿色和青草味，尤其是像小球藻这样的绿色微藻。因此，有必要通过减少或去除叶绿素来改变不利的感官特性，以增加其作为新蛋白质来源的接受度。

目前随机诱变技术在降低不同微藻中叶绿素含量应用广泛，但是化学诱变对操作者和环境都造成了严重的安全问题。而大气室温等离子体（ARTP）诱变产生的活性颗粒可以穿透细胞壁和膜，可以有效地对DNA造成多种损伤，导致突变率增加，不会产生有毒有害物质，与传统的紫外线辐射或化学诱变剂相比，成本低，环境友好。

研究人员首先对野生菌株进行第一轮诱变，并在约22000个诱变库中筛选得到4株在琼脂平板上光照培养显示浅绿色或黄色的菌株。进一步摇瓶培养分析，结果表明，所有突变体的叶绿素含量均低于野生型（图2），与此同时所有菌株的生物量未表现出显著的差异。对最优突变体A4与野生型进行葡萄糖与硝酸盐浓度进行优化，最适初始浓度为30 g/L葡萄糖和3.75 g/L硝酸盐（图3）。

以A4为出发菌株，对其进行了第二轮ARTP诱变，从16个优势菌株中挑选出5个生长性能较好的菌株，其中最佳突变体A4-1具有预期黄色外观和较高生物量浓度（图4）。通过比较WT与A4和A4-1突变体的生化组成，表明A4-1突变体具有黄色表征、更快的生长速度和更高的蛋白质含量，在感官属性和营养价值方面表现出了极大的改善。对优势菌株产生的蛋白质进行氨基酸分析，结果显示，ARTP诱变可以提高支链氨基酸的营养价值，增强Met和Cys的合成，同时蛋白质的质量也超过世卫组织制定的人体营养需求。对突变体代谢产物谱分析表明，ARTP突变可能改变了叶绿素合成中多种关键酶的表达，同时增强了氨基酸碳骨架从头合成，导致突变体中的蛋白质含量更高（图5，6）。本项研究为克服小球藻生物质作为未来食品替代蛋白质来源的应用瓶颈提供了一种很有前途的方法。

图1 本文实验流程

图2  不同菌株的叶绿素含量以及生物量

图3 不同葡萄糖和硝酸盐攻读生物量和蛋白质生产的水平

图4 WT，A4和第二轮诱变中突变体的细胞生长、生物量生产和生化成分

图5 野生型和最佳突变体A4-1代谢产物谱的比较分析

图6 WT和A4-1突变体代谢谱的比较分析

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.129907