2022/02/25 14:40
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产品配置单:
赛默飞紫外可见分光光度计Evolution 260
型号: Evolution 260
产地: 美国
品牌: 赛默飞
¥15万 - 25万
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方案详情:
引言
培养基中细菌生长( 迟缓期、 对数生长期、 稳定生长
期和衰亡期) 各个阶段都能记录下来, 其中对数期被
认为是细菌分裂最快的阶段( 1)。 使用分光光度计
测定细菌培养基在600nm( OD600) 时的光密度, 从
而监控细菌生长一直是微生物学中的一种核心技术。
使用细菌OD600的三种更为常见的应用如下:( a)
在细菌表达蛋白质时, 找到诱导蛋白的最佳时间,
( b) 用于最小抑菌浓度( MIC) 实验的接种体浓度的
确定和标准化, 和( c) 收获和制备感受态细胞的最
佳时间的确定。 研究人员继续依靠分光光度计进行这
些OD测定。 然而, 光密度不是一个吸光度指标, 而是
细菌混悬液的一种光散射指标, 将其自身作为吸光度
显示( 图1)。 分光光度计光学配置对光密度测定的
影响得到了很好的记录( 2-4)。 具有不同光学配置
的仪器对同一细菌混悬液测定得到了不同的光密度。
分光光度计光学配置上的差异对观察到的差异影响最
大。 前向光学系统采用单色光来进行吸光度的测定,
而反向光学系统则利用多色辐射进行测定, 光在其穿
过样品后再区分成单独波长( 图2)。 前向光学系统
的一些要素导致了测得OD值上的差异:( a) 样品与
检测器之间的距离,( b) 聚光透镜的尺寸和焦距大
小不同, 和( c) 检测器的面积和灵敏度( 5)。 尽管
现在都知道不同的光学配置会产生不同的OD值, 但是
研究人员仍继续关注在不同分光光度计间发现的OD值
差异。 在本研究中, 我们分析了多种光学配置分光光
度计测出的OD值差异。 我们在分批培养基中培养大肠
杆菌JM109, 并监控OD达9.5小时。 在测定之前稀释
培养基, 并将由于不同分光光度计光学元件差异造成
的不同OD值进行换算。
材料和方法:
菌株: E.coli JM109-endA1,recA1, gyrA96, thi, hsdR17
(rk–, mk+), relA1, supE44, (lac-proAB), [F′ traD36,
proAB, laqlqZ M15] (Promega, L2001)
分光光度计: 所使用的Thermo Scientific 分光光度计
会在表1中描述。
生长曲线: 50mL过夜大肠杆菌JM109在250mL带挡
板的培养瓶中培养, 于Luria Bertani(LB) 培养液中
生长(16小时, 250rpm, 37℃ )。 将12mL的过夜菌
液转移至一个2L带挡板培养瓶中培养, 加入37℃预热
的LB培养基600ml, 培养9.5小时。
培养基取样: 所有分光光度计均使用LB培养液做空白
对照。 每隔30分钟从分批培养基中取一个5mL等份试
样。 将3mL等份的未稀释培养基转移至一个10mm比
色皿中, 并采用表1中列出的所有仪器测定600nm时
的光密度。 LB培养液稀释过的等份分批培养基加入第
二个10mm比色皿中。 进行此第二次OD测定是为了确
保培养基的光密度保持在分光光度计的动态OD范围
内。
活菌计数: 每隔30分钟, 也将一等份样品进行一系列
稀释。 将稀释液涂在LB琼脂板上, 并在37℃下过夜培
养。 对菌落进行计数, 来测定各时间点的细菌细胞计
数(CFU/mL)。
McFarland标准品: 通过使用1cm路径长度的比色皿,
在各仪器(表1) 上对来自四个McFarland标准品
(Remel, R20421, 1.0-4.0)进行OD600值测定。
结果
从未稀释和稀释的培养基中收集的OD600数据如图3
所示。 将来自稀释溶液的OD600值乘以稀释因数, 并
与未稀释的样品进行对比。 两张图的分歧表明, 不同
的光学配置在光密度测定方面会有不同的动态范围。
当对比每个分光光度计的校正OD值与细胞计数时, 我
们发现, 随着时间的推移, 具有相似光学系统的仪器
产生了相似的OD曲线(图4)。 具有前向光学系统,
但却是双光束光学几何结构的BioMate 3S, 与仪器组
的差异最大。 McFarland数据呈现出一种与大肠杆菌
生长相似的曲线( 图5)。 ISA使用McFarland标准品
产生了更低的光密度(图6)。
结论
• 计算OD测定值时, 确定您所用分光光度计的光密度
性能和动态范围是至关重要的。 为获得有关生长曲
线的最准确信息, 稀释细胞混悬液是很重要的。
• OD测定在很大程度上取决于光学系统和几何学。 对
于相同的混悬液, 具有不同光学系统和配置的分光
光度计会读出不同的OD值。 例如, 在反向光学系统
Evolution Array和前向光学系统, 双光束BioMate 3S
之间有实质性的分歧。
• 积分球配件(ISA) 可捕捉几乎所有的前向散射光,
从而产生了更低的光密度。 这是因为通常看起来被
样品吸收的散射光实际上是被ISA配件所收集。 ISA
对测定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之
选; 然而, 在测定细胞混悬液的光密度时, 其是无
效的。
• 最后, 我们提出了如何计算一个可用于使OD数据标
准化, 以便能在不同分光光度计间进行适当比较的
换算因数。 值得注意的是, 这个换算因数是针对一
种特定的有机体, 因为微粒的尺寸和形状会影响换
算因数。
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