生物学实验小课堂丨荧光 PCR 原理

1．荧光染料  
荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量： 
1) 光能  

许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收峰。比如荧光染料 Fam 的光吸收峰为 490nm，而发射峰为 530nm。 
2) 热能  

某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如 Dabcyl。 
3) 转移给临近的分子 

当临近的分子满足发生能量转移的要求时，能量从荧光基团传递到临近的分子。 

 2．荧光共振能量转移  

当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。 

3．荧光 PCR   

荧光 PCR 不同于其他 PCR 的地方在于 PCR 过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出 PCR 扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的。

 4．荧光定量 PCR
1) Threshold：PCR 扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在 S 型扩增曲线的增长拐点处附近。 
2) Threshold Cycle (TC or CT) OR Cross Point(CP)：PCR 增长信号与 Threshold 发生交汇的循环数，也是 FQ-PCR 判断阴阳性和进行定量分析的依据。 
3) Standard Curve(标准曲线)：CT/TC/CP 与起始模板量的对数呈反比关系：Y=-aX+b
其中 X=Log Concentration   

Y=CT/TC/CP  
PCR 扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的 CT/TC/CP 值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。

 
5．荧光 PCR 的优点  
荧光 PCR 区别于其他 PCR 方法主要有以下优点： 
 1) 全封闭反应，无需 PCR 后处理 
2) 特异性强，灵敏度高 
3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 
4) 定量范围宽，可达到 10 个数量级 
5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 
6) 可实现一管双检或多检 
7) 操作安全，缩短时间，提高效率 
8) 利于自动化和联网管理