本文译自Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上发表的一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分期陆续介绍。本期介绍第四部分。
《Super-resolving Microscopy in Neuroscience》
荧光成像技术在我们理解神经系统中起着关键作用。各种超分辨率显微镜方法和专用荧光探针的出现使得能够以迄今为止无与伦比的分辨率直接洞察细胞亚区室中的神经元结构和蛋白质排列。
神经元的超分辨率可视化技术揭示了对细胞骨架组成、分布、运动性和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能以及神经元-胶质细胞相互作用的新认识。自身免疫性和神经退行性疾病模型中明确的分子靶点为使用新型和创新的成像方法深入研究疾病病理生理学提供了极好的起点。超分辨率显微镜在人脑样本和临床生物标志物检测中的应用仍处于起步阶段，但为神经学和神经科学的转化研究提供了新的机会。在这篇综述中，作者描述了超分辨显微镜在过去的二十年里是如何提高我们对神经元和大脑功能和功能障碍的理解的。
近年来，SRM被广泛用于神经系统疾病的研究。在许多这些疾病中，致病性病理变化局限于神经元或神经胶质细胞的小的亚细胞结构，例如突触、轴突或细胞器，并且甚至神经元和神经胶质周围的细胞外空间中的微小变化也可诱导或促进疾病进展。SRM在解决疾病模型中神经元和胶质蛋白的定位、定量和动力学方面变得特别重要。研究开始于单分子体外分析、转染细胞系、原代神经元和无脊椎动物，但已成功扩展到更复杂的标本分析，如脑切片。迄今为止，大多数应用SRM的研究仅侧重于定位和定量神经元或胶质蛋白，以揭示病理机制。然而，以高空间分辨率分析病理状态下的蛋白质动力学（如膜受体）正变得越来越重要。到目前为止，除了少数例外，绝大多数实验都是在中枢神经系统的神经变性和自身免疫性疾病模型中进行的。因此，在下文中，我们将重点关注通过超分辨率成像获得的神经退行性疾病和自身免疫性疾病的病理生理学新见解和治疗选择的进展。在相关的疾病模型中，关于小结构的精确亚细胞定位的信息，例如淀粉样沉积、蛋白质和受体聚集、或突触棘和膜蛋白动力学，是最重要的。过去，电子显微镜或原子力显微镜提供了超微结构水平上的神经元和神经胶质病理学变化的信息，例如通过确定形态学轴突或突触异常、检测储存障碍中蛋白质或脂质聚集体的异常神经元沉积、细胞器改变等。然而，样本的处理、蛋白质的特异性标记以及同一样本中多个分子靶标的解开仍然具有挑战性，并且无法探索活体标本中的动态过程。今天，SRM使科学家能够克服这些限制，并在纳米尺度上探索疾病的复杂性。此外，超分辨光学显微镜是研究和验证功能分析提出的亚细胞和分子形态学水平预测的一种优秀工具。
6.1. 中枢神经系统自身免疫性疾病的超高分辨率成像
基于免疫系统的参与，CNS的自身免疫性疾病可以非常粗略地细分为主要由失调的细胞免疫应答介导的疾病，例如多发性硬化，由B细胞或浆细胞驱动的病理性体液应答介导的疾病，例如自身免疫性脑炎，或由全身性炎症或CNS损伤后的继发性免疫机制介导的疾病，例如中风、脑膜炎、或者某些类型的癫痫。尽管纳米显微镜检查非常适用于细胞驱动免疫学的许多问题，例如用于免疫突触或免疫细胞中标记蛋白的表面分布的详细分析，但迄今为止，自身免疫性疾病中的超分辨显微镜检查主要集中于体液、抗体介导的CNS疾病。这些疾病的特点是针对定位于神经元突触或星形胶质细胞结构的特定靶点的高度特异性自身抗体，因此超高技术对于评估这类疾病病理机制极具价值。
6.1.1. 具有突触靶抗原抗体的自身免疫性脑炎
2005年，Josep Dalmau及其同事发现，表现为严重神经精神症状的免疫介导性脑炎年轻女性患者脑脊液中存在特异性IgG自身抗体（CSF）与NMDA-R的GluN 1亚基的氨基末端结构域反应。NMDA-R脑炎患者会出现严重的临床表型，包括精神病表现、记忆障碍、癫痫发作和自主神经功能障碍等。在接下来的几年里，在先前神秘的CNS疾病患者中鉴定出了大量靶向突触膜表面抗原的其他自身抗体，该疾病组现在称为自身免疫性脑炎。这些靶抗原包括CNS中几乎所有必需的离子型和G蛋白偶联受体以及其他突触前或突触后定位蛋白。每种靶抗原定义了一种具有独特临床特征的疾病亚型。
6.1.1.1. 针对NMDA受体GluN1亚单位的致病性抗体诱导受体内化并损害膜表面运输
使用共聚焦显微镜进行的第一项研究显示，将原代神经元与患者源性NMDA-R IgG抗体预孵育，可导致NMDA-R表面簇和NMDA-R介导电流减少。使用Fab片段时不存在这种减少，但使用额外的Fab抗体时可重新构建这种减少，因此证明交联对于受体内化至关重要。在使用STORM进行的更详细分析中，显示患者抗体诱导突触内纳米物体以及内化前突触外位点的NMDA-R更密集聚集。GluN2亚基特异性分析显示，含有GluN2B亚基的NMDA-R优先聚集（图13）。图13.患者源性抗NMDA-R自身抗体以亚单位特异性机制降低NMDA-R的表面表达(A)使用从NMDA-R脑炎患者的脑脊液（CSF）纯化的自身抗体观察原代神经元中NMDA-R表面表达。NMDA-R星系团以不断增加的分辨率描绘，如广角图像（左，橙色）和STORM图像（右，绿色）的放大框所示。NMDA-R纳米团簇内的定位显示在右下角的图像中，并用不同的颜色表示。(B)在指定时间点与对照患者（对照CSF，CSF −）和NMDA-R脑炎患者（CSF+）的CSF孵育后，沿树突（单位长度，微米）定量NMDA-R纳米簇。用CSF+孵育导致NMDA-R纳米簇表面表达的时间依赖性降低。红线表示中位数，点对应于单个细胞（n ≥ 29个视野;* ** p〈0.001;* *** p〈0.0001）。(C)与对照CSF −（左）和NMDA-R患者CSF+（右）预孵育24小时的原代神经元的NMDA-R亚基GluN2A（上一行）和GluN2B（下一行）的STORM图像。NMDA-R亚基纳米簇的实例显示在方框内。与NMDA-R患者CSF预孵育后，GluN2B的纳米簇大小增加。(D)在单个突触和突触外NMDA-R纳米簇中，与CSF（灰色）相比，CSF+（红色条）预孵育诱导GluN2B定位增加，因此表明局部突触重组的亚单位特异性效应优先影响GluN2B亚群。同时应用肝配蛋白B2，NMDA-R相关肝配蛋白B2受体的配体（青色条），逆转了这种效应（突触，n ≥ 2，649纳米物体;突触外，n ≥ 5，213个纳米物体;* *** p〈0.0001）。
蒙特卡罗模拟表明，除了抗体诱导的聚集和内化外，NMDA受体与突触和突触外蛋白的相互作用也被破坏。事实上，使用患者来源抗体的单分子追踪分析提供了证据，证明抗体对突触（主要是含GluN 2A的NMDA-R和由GluN 1和GluN 2B亚基组成的突触外受体）产生不同影响。人类的抗体通过阻止GluN 1亚基与肝配蛋白B2受体的细胞外相互作用，诱导含GluN 2A的NMDA-R的突触位置分散和不稳定。通常介导NMDA受体在突触后位点的滞留。此外，人类的GluN 1抗体大规模破坏突触外位点的动态膜表面运输，并降低含NMDA受体的GluN 2B含量，这可能是抗体诱导的交联和内吞作用所致。这些病理过程导致初级神经元中NMDA-R依赖性LTP受到严重影响。有趣的是，埃甫蛋白B2受体通过其可溶性配体激活，导致突触中NMDA-R锚定更有效，最终导致LTP恢复。在复杂性和转化研究的下一步中，在最近建立的NMDA-R脑炎被动转移小鼠模型中对该假设进行了检验，该模型长期应用人NMDA-R抗体至脑室系统。334此处，使用共聚焦显微镜和电生理记录，NMDA-R抗体导致海马中突触NMDA-R簇减少和Schaffer侧支-CA 1通路中LTP缺陷，最终导致学习和记忆障碍。同样，当脑室内应用肝配蛋白B2刺激肝配蛋白B2受体时，这些缺陷至少部分得到了挽救。突触信号机制是复杂的，高度浓缩在几百纳米的结构中。如上所述，靶抗原定位的微小变化可能在疾病病理生理学中诱导深远的影响。在未来的应用中，活神经元细胞和回路中动态过程的超分辨率成像以及有效和小的荧光标记策略将在评估这些病理生理学变化和治疗干预的效果方面至关重要。近年来，一些具有小连接误差的标记方法被开发用于SRM和神经元表面受体的可视化。这些包括具有SNAP和Halo标签的基因工程受体或其它基于小肽的标记方法，例如FlAsH 或PRIME。一种方法包括选择性配体−蛋白质识别以及已经应用于AMPA-Rs的靶表位的共价化学标记。使用化学AMPA-R修饰（CAM）试剂将小荧光团偶联到表面受体上而不影响受体功能。这些方法即使在脑切片中也提供了优异的标记效率，而不需要基因操作。对于NMDA-R，在HEK细胞中应用遗传密码扩展和非典型氨基酸（ncAA）插入的正交点击标记方法。在Y392 TAG（GluN 1）位置用TCO-赖氨酸过表达NMDA-R，导致GluN 1特异性和稳定标记，而不影响NMDA-Rs339的配体结合和功能特性（图14）。
(A)使用化学AMPA-R修饰（CAM）试剂通过选择性配体-蛋白质相互作用进行共价化学标记策略的示意图。CAM试剂由选择性AMPA-R配体（此处为PFQX）、配体定向酰基咪唑基团和荧光团组成。CAM试剂被设计为不影响受体功能的无痕迹蛋白标记化合物（Lg，配体部分;Nu，亲核氨基酸残基）。(B)活体神经元中AMPA-R的CAM试剂（FI，绿色）标记显示树突并置（MAP2，品红色）和共定位，AMPA-R GluA2亚基（红色）和突触后标记物（PSD-95，红色）免疫染色。概览图像中的白框（左，比例尺，10 μ m）在更详细的图像中（右，比例尺5 μ m）展开。修改自参考文献338。版权所有2018约翰威利父子.(C)NMDA-R的正交标记示意图。NMDA-R的琥珀突变NR1（GluN1）亚基通过定点诱变和插入携带TCO * A（洋红色）的非经典氨基酸（ncAA）构建，然后使用四嗪功能化染料进行点击标记。在适当的tRNA存在下，蛋白质由内源性（青色）和非天然（品红色）tRNA合成酶表达。ncAA掺入GluN1（NR1）亚基氨基末端结构域（ATD）的示例（箭头）。(D)HEK293T细胞中NMDA-R GluN1（NR1）亚基的正交标记与免疫细胞化学的比较。上排：在TCO * A（-ncAA）存在下用点击突变体Y392TAG（青色GFP表达）共转染并用H-tet-Cy5（品红色）点击标记的HEK293T细胞。下排：用市售抗NR1抗体（抗NR1Ab）和Alexa Fluor 647作为第二抗体（品红）进行免疫染色。注意，与抗体染色相比，点击标记显示出更明亮和致密的膜标记。比例尺：10 μ m（概览图像），5 μ m（放大图像，右侧）。
这些正交标记技术现在可以转移到神经元和脑组织，例如通过使用病毒载体的过表达。此外，该技术还可用于标记针对NMDA-R的重组单克隆抗体，以及最近从患者脑脊液或血液B细胞和浆细胞中亚克隆的自身免疫性脑炎的其他靶点。这些方法将为研究NMDA-R靶向病理提供一个极好的机会，其精确度和灵敏度迄今为止无与伦比，例如通过活体超分辨成像。近年来，一些研究报道了低滴度血清抗NMDA-R抗体的存在（主要是伊加和IgM血清型）也存在于原发性精神疾病患者中，例如疑似影响疾病发病机制的精神病或精神分裂症。然而，类似的研究还发现，在没有任何神经和精神症状的健康个体中，高达10 - 20%的血清呈阳性结果，最近的研究使用更可靠的试验，包括血清培养活的初级神经元和脑切片，但不能重现这些结果，因此质疑其致病相关性。鉴于这些有争议的报道，原代神经元中NMDA-R的单分子追踪被认为是检测患者血清中低滴度NMDA-R抗体的更灵敏方法。精神病患者的低滴度IgG抗体增加了NMDA-R表面动力学，并通过单分子量子点耦合GluN2A追踪测量显示其位于突触区域。dSTORM显示突触NMDA-R纳米物体的面积减少，突触NMDA-R含量随时间减少。与来自NMDA-R脑炎患者的IgG抗体所报道的相似，这些抗体导致埃甫蛋白B2的突触滞留减少和谷氨酸能突触处NMDA-R介导的LTP受损。需要进一步研究来验证这些发现的临床意义，因为从NMDA-R脑炎中恢复的患者可能显示出长期保持低滴度的NMDA-血清和CSF中的R抗体而不发生精神病发作。此外，来自报道的精神病患者的抗GluN1抗体不与来自NMDA-R脑炎患者的GluN1抗体竞争结合，已知所述NMDA-R脑炎患者的GluN1抗体与GluN1的胞外ATD结构域相互作用。迫切需要用同样稳定但小得多的标记物来改进标记策略，以进一步研究突触区域受影响的表面运输。量子点/抗体构建体与突触间隙相比具有相似的大小，因此空间位阻可能影响迁移率和表面运输的评估，尤其是在突触区域。如上所述的正交或配体指导的化学标记方法可能克服这些限制。
6.1.1.2. 超分辨率成像观察自身抗体对靶蛋白功能的干扰
除了影响膜表面运输和交联外，致病性自身抗体还可干扰靶抗原功能。具有两栖生理素抗体的僵人综合征（SPS）是一种罕见的自身免疫性中枢神经系统疾病，其核心症状是肌张力增加，导致间歇性、刺激敏感性肌肉痉挛和僵硬。这些抗体靶向功能相关的SH3亚结构域，该亚结构域介导两栖生理素与动力蛋白的相互作用，这是网格蛋白介导的囊泡内吞作用的重要机制。在被动转移动物模型中，重复鞘内应用患者源性和亲和纯化的IgG抗体，STED显微镜显示抗体在体内富集于脊髓突触的突触前末端，并与囊泡蛋白共定位，例如囊泡GABA转运蛋白VGAT.317。在体外，两栖生理素抗体被表位特异性机制摄取和内化，这是通过使用量子点标记抗体的活成像方法揭示的。这些抗体依赖性过程导致囊泡内吞作用减少，因为STED成像显示突触前蛋白AP180的聚集增加，特别是在GABA能突触和苯乙烯基FM染料的缺陷囊泡负载处。用这些抗体处理的原代神经元GABA能突触前结的dSTORM揭示了GABA能突触末端的结构和功能紊乱，通过证明活动诱导的静息池囊泡耗竭，突触小泡蛋白7减少，两栖生理素相互作用伴侣亲内蛋白聚集减少。被动转移人类两栖生理素抗体后，大鼠脊髓的超微结构分析显示GABA能突触前网格蛋白依赖性内吞作用的刺激依赖性干扰，导致突触前囊泡池和网格蛋白包被的中间体耗竭。因此，GABA能神经传递在体外和体内均减少，最终导致僵硬和叠加肌肉痉挛的特征性疾病症状。总之，这些实验表明致病性抗体直接干扰靶抗原的功能重要的SH3结构域。最近，在自身免疫性脑炎中发现了另一个可能是直接致病性抗体-抗原相互作用的例子，与靶向突触连接蛋白LGI 1（富含亮氨酸的胶质瘤灭活1）的抗体相关。LGI 1是一种神经元分泌蛋白，通过衔接蛋白ADAM 23介导突触前Kv1.1通道聚集，通过ADAM 22介导突触后AMPA-R聚集。LGI 1脑炎患者患有特征性局灶性癫痫发作和顺行性记忆缺陷。最近使用患者源性多克隆和重组人单克隆抗体的研究表明抗体针对富含亮氨酸的重复序列（LRR）或表位模板LGI 1的（EPTP）结构域介导LGI 1 − LGI 1相互作用或LGI 1分别与ADAM 22和ADAM 23相互作用。使用各种成像技术进行的体外和体内研究表明，抗体导致突触前和突触后病理学，导致突触后AMPA-Rs和突触前Kv 1减少。功能分析显示神经元过度兴奋，这很可能是由受干扰的Kv1.1信号传导的突触前病理机制引起的。在接下来的步骤中，需要详细解决这种复杂的LGI 1定向信号传导干扰，以剖析突触前和突触后病理。超分辨突触成像与所有相关LGI 1相互作用伙伴的精确绘图以及突触前功能的直接分析可能是揭示疾病病理生理学的最有前途的策略，最终导致靶向治疗策略的确定。
6.1.1.3. AMPA受体脑炎：GluA2抗体引起突触缩放和突触可塑性缺陷
AMPA-Rs是heteromeric ionotropic谷氨酸受体调节的绝大多数快速在中枢神经系统兴奋性信号。自身免疫性脑炎患者和病原的抗体AMPA-R患有顺行记忆功能障碍、癫痫发作、精神异常,因此表现出的症状特征边缘脑炎hippocampusamygdala通路的主要情感。体外实验研究提供的证据表明,人类自身抗体AMPA-Rs诱导受体内部化,减少突触集群类似NMDA-R病理学。Antibody-induced减少突触GluA2-containing AMPA-Rs随后更换non-GluA2-containing AMPA-Rs增加电导和Ca2 + permeability287类似突触scaling-like机制。此外,应用GluA2抗体体内导致有缺陷的记忆和干扰突触可塑性。年在更一般的情况下,这一现象还与非人类观察到抗体AMPA-R导致AMPA-R交联所示和集群体内注入老鼠体内和体外单分子跟踪分析。年这些观察强调准确的重要性ionotropic谷氨酸受体定位和完整的膜表面流动对于维护网络活动确保记忆形成和存储(图15)。
图15.致病性GluA2 AMPA-R抗体诱导的AMPA-R表达的突触重组
(A)用对照IgG（ct IgG，左）或来自自身免疫性脑炎患者的IgG制剂和AMPA-R的GluA2亚基抗体（a-GluA2 IgG，右）预孵育的原代神经元的神经元树突的共焦图像。GluA2（上一行）和GluA1（下一行）与突触后标记homer1共染色（比例尺：5微米）。(B)自身抗体孵育后dSTORM记录的示例性重建显示了GluA2定位的突触定位（洋红色）。突触后区域由各向同性延伸（50nm）的homer1表达（绿色;比例尺：200nm）。(C)对dSTORM记录的分析揭示了在homer1定义的突触后区域内突触GluA2定位的减少，而突触GluA1定位没有显著变化，因此表明抗体介导的突触后受体场中AMPA-R组成的变化（p = 0.003，Mann-Whitney U检验）。
6.1.2. 针对胶质细胞抗原的自身免疫疾病-视神经脊髓炎谱系障碍（NMOSD）
NMOSD是一系列自身免疫、抗体介导的CNS疾病，其中致病性抗体针对水通道蛋白4（AQP4）水通道，位于面向CNS微血管外腔侧的星形胶质细胞末端足。NMOSD的主要病理机制包括效应器激活，尤其是补体和免疫细胞的激活（分别为补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性），导致细胞死亡和严重炎症。NMOSD患者患有CNS中广泛的炎症和脱髓鞘病变，主要位于脊髓，脑干和视神经。AQP4介导星形胶质细胞的渗透调节，并在膜上形成超分子聚集体。dSTORM和QDot追踪实验表明AQP4的寡聚化状态决定了其在星形胶质细胞中的定位。通过定位显微镜测量小鼠大脑皮层和脊髓、人类死后大脑和神经胶质瘤活检标本的抗体染色石蜡切片中AQP4簇的大小。此处，较大的簇定向至星形胶质细胞端足，以获得高容量水通量，而非簇AQP4均匀分布在星形胶质细胞质膜上，以允许神经元活动诱导的快速体积变化。异源四聚体AQP4通道存在两种亚型（M1和M23），并在细胞膜中组装成超分子聚集体，称为正交颗粒阵列（OAP）。由于OAPs小于衍射极限，因此使用各种超分辨率成像方法研究了AQP4和OAPs的排列和动力学，包括量子点单颗粒追踪、PALM和dSTORM、和单分子光漂白。这些分析表明，OAP特性取决于M1：M23 AQP4比率和排列，决定了抗体结合后效应物激活的效力。一些研究AQP4抗体在细胞培养和NMOSD动物模型中作用的报道也提示了内在的或补体非依赖性的致病机制，这些机制可能是由亚型特异性AQP4内化或AQP4相关兴奋性氨基酸转运蛋白表面表达减少介导的（EAAT2）。然而，这些假设在其他研究患者来源的多克隆和重组自身抗体对活星形胶质细胞的影响的研究中没有得到支持。此处，使用PALM和dSTORM，AQP4抗体未改变AQP4超分子组装、OAP大小或动力学，也未诱导AQP4或EAAT2内化。此类效应器非依赖性机制是否也发生在NMOSD中仍存在争议。根据对活细胞中AQP4和OAP纳米级组装的新认识，很明显，致病性NMOSD相关抗体优先结合聚集组装的AQP4通道，OAPs中靶向AQP4的IgG抗体增强了补体蛋白C1q激活的效力，从而导致经典补体级联反应的启动。
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