文献解读
图1、由纤维素微纤丝、半纤维素和果胶组成的植物细胞壁结构,摘自[1]。
与动物细胞不同,植物细胞被坚固的细胞壁所包围。植物细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶和细胞壁蛋白质构成,它们的组成和排列方式会随细胞内部和外部刺激而动态变化[2]。目前已有多种技术应用于植物细胞壁成像,比如原子力显微镜、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱和拉曼显微镜等,然而这些技术都有化学分辨率或空间分辨率低的缺陷。
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研究介绍
2020年,Science杂志发表了巴黎萨克雷大学Alexis Peaucelle和英国剑桥大学Kalina T. Haas等研究人员合作的题为“Pectin homogalacturonan nanofilament expansion drives morphogenesis in plant epidermal cells”的研究论文。
该研究的创新点在于将传统的能够准确标记细胞内多种大分子的免疫组织化学染色技术与多色三维随机光学重构超分辨率显微镜(3D-dSTORM)结合,使对细胞壁多糖高灵敏度、高分辨率成像成为可能。STORM超分辨技术由华人科学家庄小威发明,其将显微镜分辨率推进到几纳米,比光学衍射极限高近两个量级,极大地促进了生物医学研究(图2)。
图2、普通成像与STORM成像效果对比。微管(绿色)和网格蛋白小窝(红色)经过免疫荧光标记(摘自庄小威实验室网站)。
植物细胞壁是多糖 (例如纤维素,半纤维素和果胶) 的复杂复合物。细胞壁被认为是双相的: 被半纤维素束缚的结晶纤维素微纤维被淹没在果胶和蛋白质的凝胶状基质中。果胶构成了结构多样的多糖家族,具有1,4-连接的 α-半乳糖糖醛酸 (GalpA) 的定义特征。作者专门研究了仅包含GalpA线性链的高半乳糖醛酸 (HG) 多糖。高半乳糖苷在含有更复杂和分支的果胶的杂聚糖 (鼠李糖半乳糖苷I和II型) 以及糖缀合物 (如蛋白聚糖APAP1) 中也以HG聚糖结构域的形式存在。
02
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研究结果(部分)
作者使用超分辨率三维直接随机光学重建显微镜 (3D-dSTORM)和低温扫描电子显微镜 (cryoSEM) 展示了 HG 的同聚糖聚合形式的 muro 纳米结构。作者发现,在子叶背斜壁中,HG 组装成离散的纳米丝,而不是连续互连的网络。作者认为它们可能是类似于 X 射线衍射观察到的四元结构。由此,作者制定了路面细胞形态发生的内在细胞壁膨胀“扩展梁”模型。在该模型中,局部同型半乳糖醛酸去甲酯化导致纳米丝径向膨胀,这是由具有不同包装的四元结构之间的转换引起的。作者通过证明单独 HG 的去甲基酯化足以诱导组织扩张来进一步检验这一假设。最后,作者将该模型形式化为预测组织拓扑、局部细胞壁厚度、张力和生长的三维非线性有限元方法 (FEM) 模型。
3D-dSTORM纳米镜可深入了解纳米级的生物结构。作者在4微米厚的组织切片上结合3D-dSTORM和使用针对高甲基酯化 (LM20) 和低或未酯化 (2F4) HG的抗体进行免疫标记,获得了约40-50纳米的横向和约80纳米的轴向分辨率和约800纳米的深度重建。两种抗体在靠近质膜的细胞壁中结合,但很少在中间薄片中结合,这表明抗原表位对抗体的可及性有限,或者在该位置缺乏这种表位(图3B)。
图3、3D-dSTORM纳米镜和cryoSEM揭示了同型alacturonan纳米丝。
3D-dSTORM揭示了在背斜壁中HG形成垂直于子叶表面的排列细丝,作者称之为HG纳米丝 (图3C)。它们的估计宽度为〜40 nm (图3D)。相反,在周壁中,作者没有检测到丝状模式,这表明在相同细胞的不同壁中具有独特的HG组织 (图3E)。作者发现改变果胶的甲酯化程度会影响细胞生长,挑战了此前公认的细胞膨压驱动细胞生长的理论。
图4、HG甲基化不对称性影响叶形成。(A) 在WT,PME5oe和PMEI3oe子叶中使用3d dstorm成像的代表性叶状壁段。橙紫色色图编码Z位置。比例尺,500 nm。
同时,作者整理了其中关键的实验技术方法,并以“Multitarget Immunohistochemistry for Confocal and Super-resolution Imaging of Plant Cell Wall Polysaccharides”为题发布在Bio-protocol期刊[4],以期使更多科研人员能够将免疫组化与3D-dSTORM结合的思路应用到自己的研究中。
03
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超高分辨显微成像系统iSTORM
本文所介绍的细胞壁多糖超分辨率显微成像技术促进植物发育研究领域的研究提升,其中所涉及的STORM技术目前已在国内实现商业化。
现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM,成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破,使得在 20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及超分子结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实,从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
超高分辨率显微成像系统 iSTORM 具有 20 纳米超高分辨率、3通道同时成像、3D同步拍摄、实时重构、2小时新手掌握等特点,已实现活细胞单分子定位与计数,并提供荧光染料选择、样本制备、成像服务与实验方案整体解决方案,拥有纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性。
参考文献
1. L. Vaahtera, J. Schulz, T. Hamann, Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Nature Plants 5, 924-932 (2019).
2. Y. Zhang et al., Molecular insights into the complex mechanics of plant epidermal cell walls. Science 372, 706-711 (2021).
3. K. T. Haas, R. Wightman, E. M. Meyerowitz, A. Peaucelle, Pectin homogalacturonan nanofilament expansion drives morphogenesis in plant epidermal cells. Science 367, 1003-1007 (2020).
4. K. T. Haas, M. Rivière, R. Wightman, A. Peaucelle, Multitarget Immunohistochemistry for Confocal and Super-resolution Imaging of Plant Cell Wall Polysaccharides. Bio Protoc 10, e3783 (2020).
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