【学术前沿】STORM成像在肾小球基底膜研究中的应用

慢性肾脏疾病影响着世界上10%以上的人口，其中大多数源于肾小球的损伤。肾小球过滤屏障（GFB）是一种能够在血流和尿液之间选择性渗透的复杂结构。作为GFB组成部分之一的肾小球基底膜（GBM），是肾小球超滤的重要介质，它由内皮细胞和其两侧足细胞分泌的细胞外基质（ECM）蛋白组成。一旦GFB中的任何组成部分出现损伤或遗传缺陷都将会导致肾小球过滤屏障功能障碍，从而使得尿液中蛋白质含量升高引发肾脏疾病。

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研究介绍

Suleiman等人通过结合来自亚衍射分辨率随机光学重建显微镜（STORM）和电子显微镜（EM）的数据，表明小鼠和人的肾小球基底膜中蛋白质排列相似，形成了独特的分层结构，这表明基底膜组织在肾功能中起着关键作用。

同时，该研究揭示了细胞外基质蛋白的超微结构，通过对小鼠和人GBM中聚集蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白IV的N-末端和C-末端附近结构域的单独分析，揭示了高度定向的大分子组织。除此之外，这项工作还提供了一种研究不同类型组织中基底膜结构的方法，首次实现了对复杂ECM组织的纳米级观测。

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研究结果

1、用STORM和STORM/Deep-Etch电子显微镜对比成像肾小球滤过屏障的超微结构

为了揭示 GBM 内的超分子结构，作者使用与 Alexa 647（一种明亮的荧光光敏染料）结合的抗体对肾脏切片中的肾小球进行了 STORM 成像。

由于 GBM 内致密的蛋白质网络产生了强烈的荧光背景和光散射，对从肾脏切片获取高分辨率 STORM 数据构成障碍，作者对固定和组织切片方法进行了改进，并最终确定在 200 纳米(nm)厚度下对 Tokuyasu 冷冻包埋和冷冻切片最佳。

为了研究集聚蛋白（GBM的主要HSPG成分）在GBM中的组织，作者首先用抗集聚蛋白 C 的抗体标记肾切片，与传统的 agrin 免疫荧光图像相比，STORM 在 GBM 中解析了两个不同的 agrinC 层（图1-A，图1-B）。

图1、鼠GBM的STORM和STORM-EM图像相关性

为了定量记录 agrinC（集聚蛋白的 C 端 ）的分布，作者数字化选择了肾小球的多个区域。通过抗 agrinC 和唾液蛋白 podocalyxin 的抗体进行双重标记，对 GBM 与侧翼足细胞和内皮细胞之间的关系进行成像，后者在内皮细胞和足细胞表面都有表达。双通道 STORM 成像显示，两层 agrinC 确实位于两层 podocalyxin 之间（图1-E、图1-F和图1-图补充 1）。

图1-图补充1、EM/STORM相关的低放大倍率图像

为了进一步关联 STORM 分子定位，作者开发了一种混合 STORM-电子显微镜 (EM) 方法（参见图1-图补充2中的示意图），同样也证实了 GFB 的超微结构特征。

图1-图补充2、示意图显示处理样品的步骤

2、在 GBM 内定位分子

在建立了样本制备、STORM 成像和 EM 相关性的方法后，通过比较各种 ECM 组件的位置来分析 GBM 的分子组织。利用 agrinC 的稳健和双峰分布，作者使用了一种定位方案，其中两个 agrinC 层之间的中心位置被设置为原点，第二个蛋白质的位置，与 agrinC 一起通过双色 STORM 成像，通过在多个区域和肾小球上重复该过程，可以高精度地确定 GBM 中各种蛋白质表位的位置。本研究中绘制的各种 ECM 蛋白及其表位如图2-图补充1所示。

图2、在GBM内定位分子结构域

图 2-图补充1、抗原表位与Agrin、Laminin和Collagen IV结构之间的关系

3、肾小球基底膜成分在Alport综合征小鼠模型中的分布

肾小球基底膜（GBM）成分的独特分布促使作者评估 GBM 的组织是否在基底膜的特定疾病中受到破坏。因此，作者分析了常染色体隐性遗传 Alport 综合征的小鼠模型，该模型由于 COL4A3 无效突变而缺乏胶原α3α4α5（IV）网络。

在人类和小鼠中，该网络的缺乏会导致胶原 α1α1α2（IV）表达的代偿性增加，通常会在成人 GBM 中以低水平被发现。尽管有这种代偿作用，GBM 仍会出现节段性分裂和增厚，这与血尿、蛋白尿和进行性肾功能衰竭有关。

为了研究该疾病模型中 GBM 的结构，作者检测了 agrinC 和胶原α1α1α2（IV）的组织，最终得出结论，完整的胶原 α3α4α5（IV）网络有助于维持健康 GBM 中聚集蛋白和胶原 α1α1α2（IV）的组织。（图3）

图3、Alport综合征小鼠模型中GBM分子结构的分解

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研究总结

确定细胞外基质蛋白（ECM）的结构、分子相互作用以及空间组织是理解其在组织功能、形态发生和疾病中发挥作用的重要步骤。该研究描述了一种新的超分辨率荧光显微镜方法来重建 GBM 内 ECM 蛋白的分子结构，并且通过使用 STORM 和 EM 对同一样品进行超微结构成像，实现了在致密组织切片中观测系统的纳米级分子映射。这种方法的稳健和相对快速的吞吐量使我们能够重建小鼠和人类恶性胶质瘤（GBMs）的分子结构。

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参考文献：

Hani Suleiman, Lei Zhang, Robyn Roth, John E Heuser, Jeffrey H Miner, Andrey S Shaw, Adish Dani (2013) Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane eLife 2:e01149