光学探秘 | 超分辨率显微成像技术介绍-PALM

光学探秘 | 超分辨率显微成像技术介绍-PALM

超分辨率荧光显微成像系统由于其可以实现纳米级的成像分辨率，且对样品破坏性小，可进行三维成像，可进行活体样品观测等特点，在近十几年来受到生命科学、显微成像、计算机等等领域科学家的广泛关注，并促使了一系列适合生物样品成像的超分辨率成像技术的开发与应用。包括随机定位光学重建显微技术（STORM），光激活定位显微技术（PALM），受激发射损耗荧光显微技术（STED），结构光照明显微技术（SIM）等等突破光学衍射极限的成像技术，为人们打开了一扇认识纳米尺度世界的大门。

在之前一系列的文章当中，已经为大家介绍了STORM，DNA-PAINT等超越分辨率的技术手段，如果大家有心注意就会发现，其实STORM和DNA-PAINT超越分辨率的原理方法都是一致的，是利用荧光染料光切换（STORM）或者DNA链条自发结合和脱离（DNA-PAINT）产生的“闪烁”效果，来顺序获得感兴趣样品的离散信息，最后通过叠加的方式来“重构”样品全貌。所以他们都隶属与荧光定位显微重构这种超分辨率成像的大家族，而这个家族中还有一种非常重要的成像技术，也就是本篇文章介绍的主角——PALM。

我们知道，在显微成像的过程中，对样品发出的荧光进行成像与其他获得对比度的成像方式相比，可以获得更高的对比度，且具有特异性强，可进行多通道成像等诸多优点。获得样品上的荧光信号主要有以下几种方式，生物样品的自体荧光、荧光物质标记、基因设计的荧光团（荧光蛋白）、量子点标记等。在荧光定位超分辨率显微成像过程中，如果利用的是荧光染料光切换的性质，即为STORM成像技术，而如果利用的是某些荧光蛋白在特定条件下产生的光切换性质，来获得超越衍射极限的成像结果，就是PALM（photoactivated localization microscopy）技术。

一，PALM工作原理

图1，PALM超分辨率显微成像系统原理及示意图

PALM显微成像系统的简要光路示意图由图1-G所示，405nm激光器和氩离子激光器通过二向色镜合束，并且通过透镜L1聚焦在物镜的后焦平面，之后通过物镜，照射到生物样品表面，激发样品上的荧光物质，样品上发出的荧光被物镜收集，并且通过二向色镜和滤波片，经过显微镜筒镜成像在CCD上。

由图1A-1F所示，为了激发样品中的荧光蛋白“闪烁”并随机成像，系统的工作流程为，图1-A显示的使氩离子激光器的照明范围，图1-B显示的为405nm激光器的照明范围。当405nm激光器照射到样品上时，初始处于暗态的很少一部分荧光蛋白PA-GFPs被激活，在氩离子激光器的照射下被激发，然后发射出荧光，被成像光路接收在CCD上进行成像，这些CCD接收的初始图像会进一步经过算法处理，对图象上的荧光点位置进行定位和记录。之后，这些被激活激发的荧光蛋白会被漂白，不再发射荧光。经过几轮这样“激活-激发-成像-定位-漂白”的循环过程，感兴趣的样品结构会逐渐显示在重构后的超分辨率图像上面，收集到足够的荧光蛋白位置信息之后，循环即可停止，超分辨率成像过程结束。

可以看出，为了实现PALM成像，标记感兴趣结构的荧光蛋白必须使光激活荧光蛋白，例如PA-GFP是GFP（Green fluorescent protein）的变种，可以被405nm的激光照明激活，激活后的PA-GFP可以在488nm激光的照射下产生荧光，而使用单独的488nm激光照射并不会激发PA-GFP。

二，成像效果

图2 PALM成像效果

图2展示的样品为COS-7细胞，感兴趣的结构为荧光蛋白标记的溶酶体跨膜蛋白CD63，图2-A为TIRF成像效果，图2-B为PALM成像效果，图2-C展示了100nm范围内PALM成像的细节，可以看出与TIRF成像相比，PALM的超高分辨率成像效果可以使我们获得样品上更加精细的结构信息。

图3，多通道PALM成像效果

运用不同的PA-FP组合，也可以进行多通道成像，图3即为双通道PALM成像效果，样品为EpH4细胞，线粒体外膜蛋白使用PAmCherry1-Lk-BclXI进行标记，线粒体内膜使用BCS1L-LK-rsKAme标记。为了获得多通道PALM成像，需要设计合适的PA-FP组合，并且使用相对应的激活和激发激光，时序控制激光发射顺序，对样品进行成像，所以对于显微镜成像系统的设计也有比较高的要求。

三，一些讨论

PALM和STORM虽然同属荧光定位显微成像系统，但是由于样品标记的技术手段不同，还是产生了一些差别：第一，STORM使用荧光染料对样品进行标记，而PALM使用荧光蛋白对样品进行标记，在样品“闪烁”的过程中，通常荧光染料产生的光子数比荧光蛋白产生的光子数多，所以理论上来说STORM的空间分辨率会比PALM的空间分辨率更高；但是如果对实际样品进行分析，使用荧光染料标记样品时，通常会用到抗体标记，而抗体的大小也会对感兴趣结构的空间分辨率造成影响，所以需要结合具体情况，去比较两种技术的空间分辨率；第二，STORM和PALM对显微镜照明及成像系统的配置，及控制流程要求不同；第三，PALM更容易对活细胞进行超分辨率成像，STORM进行活细胞成像时，需要采用可以对活细胞进行标记的染料；第四，与STORM成像相比，PALM成像对样品制备和处理的要求较高，需要根据具体需求摸索实验条件，因此具有较高的使用门槛。

宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）致力于最前沿的超高分辨率显微技术研究和产品开发，拥有包括PALM在内的多种超高分辨率技术的技术储备，可满足客户定制化需求。现已成功实现商业化的iSTORM超分辨率显微系统，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。

参考文献：

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Rosenbloom, A. B., Lee, S.-H., To, M., Lee, A., Shin, J. Y., & Bustamante, C. (2014). Optimized two-color super resolution imaging of DRP1 during mitochondrial fission with a slow-switching DRONPA variant. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(36), 13093–13098. https://doi.org/10.1073/pnas.1320044111