总 RNA 提取试剂盒
Total RNA Extraction Kit
规格:100ml
保存条件:
4℃避光密闭保存,保质期 12 个月。
产品简介:
总 RNA 提取试剂盒是基于 TriZol 原理制备的一种通用总 RNA 提取试剂,采用优化的裂解液配方,裂
解能力强,具有广泛的样本适应性。该方法简便、快捷,适用于动植物细胞、组织、酵母细胞以及细菌的
总 RNA 抽提。其原理是利用异硫氢酸胍/酚/氯仿法,快速裂解细胞,溶解细胞内含物,抑制核酸酶活性,
从而有效防止 RNA 在提取过程中的降解。加入氯仿后,溶液分为水相和有机相。RNA 保留在上层水相中,
分离后可用异丙醇沉淀回收。本产品提取的总 RNA 产量大、纯度高,无基因组 DNA 和蛋白质污染,可直
接用于 RT-PCR、Northern blot、dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护实验和分子克隆等一系列
操作。
注意事项:
1. 试剂中含有苯酚等有害物质,应在通风橱内操作并使用个人防护用品如实验服、手套、防护眼镜或面具等,防止皮肤接触和吸入。
2. 预防 RNase 污染:
1)采用无菌操作规程;经常更换新手套,防止样品由于皮肤携带的细菌、真菌而导致的 RNase 污染。
2)使用经 DEPC-ddH2O 处理过的塑料容器和枪头,避免交叉污染。
3)RNA 在提取液 中不会被 RNase 降解。但后续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h,塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min,然后用水彻底清洗后灭菌烘干使用。此外,使用 Rnase 清除剂对实验器皿、实验仪器和工作台面进行处理,可有效去除RNase,提高工作效率。
4)配制溶液应使用无 RNase 的水(制备方法:在去离子水中加入终浓度为 0.05%(v/v)的 DEPC,充分混合,室温或 37℃放置过夜,高温高压灭菌)。
5)实验前需准备的试剂:RNA 实验专用的氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC-ddH2O 配制)、DEPCddH2O 或 TE 缓冲液(DEPC-ddH2O 配制)。
6)匀浆后加氯仿前,样品可在-80℃放置一个月以上;溶解在 75%乙醇中的 RNA 可在 4℃保存一周或-20℃保存一年。
操作流程:
1. 细胞裂解
组织样本:
提取液用量:每 50-100 mg 组织加 1 ml 提取液,样品体积不应超过提取液体积的 10%。
1) 将动物或植物组织切成小块,在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。
2) 将研磨好的组织粉末快速转入装有 1 ml 提取液的 2 ml 离心管中,在涡旋振荡器上迅速振荡混匀,置于冰上,待所有的样品研磨完。
3) 裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等,匀浆后仍会存留有不溶物质,可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min,然后吸取上清至一新的离心管中。
细胞样本:
1) 贴壁细胞:吸尽培养液,每 10 cm2 培养面积(6 孔板单孔或 35 mm 平皿)加入 1 ml 提取液,用加样器吹打数次,以确保细胞完全裂解,然后转移至离心管中。
注:提取液的使用量应由培养皿表面积决定,而非由细胞数目决定。提取液量不足可能导致提取的 RNA中有 DNA 污染。
2) 悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,每 5-10×106 动植物或酵母细胞,或每 1 × 107 细菌细胞加入 1 ml 提取液,用加样器吹打,使其完全裂解,然后转移至离心管中。
注:添加提取液前切勿洗涤细胞,以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。
2. 液相分离
1) 裂解产物于室温放置 5 min,使核酸-蛋白复合物完全分离。(注:此时样品可在-80℃长期保存。)
2) 每 1 ml 提取液 加入 0.2 ml 氯仿,盖紧管盖,剧烈振荡 15 s,室温放置 2-3 min。
3) 4℃ 12,000 x g 离心 15 min,样品会分成三层:桔黄色的下层有机相,中间层和无色的上层水相。
4) 吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管中,吸取水相的体积为所用提取液 试剂的 60%。
3. RNA 回收
1) 按照每 1 ml 提取液 的最初使用量加入 0.5 ml 异丙醇,颠倒数次混匀,室温放置 10 min。
2) 4℃ 12,000 x g 离心 10 min,弃除上清,可见胶状的 RNA 沉淀。
3) 按照每 1 ml 提取液 的最初使用量加入 1 ml 75%乙醇,颠倒数次混匀,洗涤沉淀。
4) 4℃ 12,000 x g 离心 5 min,弃除上清。
5) 室温倒置 5-10 min 晾干或真空抽干(不要使用真空干燥离心机,以免 RNA 过干,难以溶解)。
6) 加入适量(如 25 μl) DEPC-ddH2O 或 TE 缓冲液,用加样器吹打数次溶解 RNA。
7) 通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测,确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。
8) 所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存,避免反复冻融。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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