【产品名称】登革病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒(荧光RT-PCR法)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中登革病毒通用型RNA,适用于登革病毒通用型感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,通过设计一对登革病毒通用型特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光PCR技术对登革病毒通用型的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μL×1管 |
登革病毒通用型反应液 | 1100μL×1管 |
登革病毒通用型阳性质控品 | 200μL×1管 |
阴性质控品 | 200μL×1管 |
备注:不同批号的试剂盒组分不宜交叉使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融≤5次,有效期12个月。
【适用仪器】
ABI系列 、安捷伦MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀动物,取分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过6个月,标本运送应采用2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
组织样品:每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;
全血及血清样本:待血凝固后,取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中,进行核酸提取。
棉签采集样本:用超纯水或生理盐水浸泡后,离心后取澄清部分,直接检测无需提取核酸。
其他液体类样本:离心后取澄清部分,直接检测无需提取核酸。
1.2核酸提取
按照相应RNA核酸提取试剂盒进行核酸提取,核酸提取产物-20℃保存。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照,每个测试反应体系配制如下表:
试剂 | 登革病毒通用型反应液 | 酶液 |
用量(样本数为N) | 19μL | 1μL |
3. 加样(样本处理区)
将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4. PCR扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL;
荧光通道选择: AIV检测通道选择FAM,NDV检测通道选择VIC, 淬灭通道选择NONE,参比荧光选NONE。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1结果分析条件设定
5.2设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.3结果判断
阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。
6. 质控标准
阴性质控品:无明显扩增曲线或无Ct值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct值≤30;
以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
所有操作严格按照说明书进行;
试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
反应液应避光保存;
反应中管盖需盖紧;
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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