荧光及可视化RT-LAMP扩增试剂盒

荧光及可视化RT-LAMP扩增试剂盒

产品及特点 本产品是根据本公司的双染料 RT-LAMP 专利技术开发的荧光和可见光双模式检测试剂盒，它既可以用于荧光 RT-LAMP 扩增及检测，也可以用于可视化 RT-LAMP扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。本产品具有下列特点：
1. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。
2. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
3. 特异性比 RT-PCR 高，因为 RT-LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
4. 灵敏性可达 10 拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。

5. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。

规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。
自备试剂 RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 60-65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远远不如 PCR 仪器，所以使用前需要用阳性对照和阴性对照（水）做预实验确认可用。
一、样品 RNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 RNA 提取操作，得
到 N+2 个 RNA 样品。
二、合成 1st-strand cDNA
3. 按下表配制 RT 反应体系:

4. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

5. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保温 5 分钟。

6. 加入 1μL (=200 U) MMLV 逆转录酶（含 RI），终体积为 20μL。

7. 42℃保温 60 分钟。

8. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 LAMP 模板使用，不需要纯化。 三、 荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）

9. 反应设置：如果有 N+2 个 cDNA 样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 阴性对照和 LAMP 阳性对照各 1 个。在 N+4 个 0.2mL PCR 管中加入下列成分：

10.混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三种方式进行扩增和检测。

11.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中加 30 μL 自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率（如果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。60-65℃保温 90 分钟，肉眼观察管内液体颜色。
12.如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 60-65℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环，每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
13.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数：则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度设为 60-65℃，1次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。注意：测荧光读数必须在 65℃进行）。扩增反应按 60-65℃，90 分钟进行。
四、 结果分析及解读
14.如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反应管放置在白色背景（如白纸）前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。
15.如果实验有效，则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例见左图（9 为阴性，10 为阳性）。
16.如果是用荧光 PCR 仪进行扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照的 Ct 将小于 60，如果大于 60，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则分析样品的 Ct。Ct 小于 60 的判断为阳性，大于 90 判为阴性，在 60-90 之间则需要重复检测。
17.如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量 PCR 仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过 100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于 50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50-100%之间的，则需要重测。
18.当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致，以实时荧光LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果 20-30 分钟，也就是说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化一般在第50-60 分钟时才能观察到。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！