动植物膜蛋白微量制备试剂盒
产品及特点
细胞膜蛋白质参与了很多重要的细胞活动,根据它们与膜结合的位置一般分为两种,一种是附着在细胞膜上,另一类是嵌入到细胞膜中间。附着型膜蛋白疏水性较弱,比较容易提取和纯化;而嵌入型膜蛋白疏水型很强,所以在水溶液里面很难溶解,非常难以提取和纯化。基因根据上述特点,经过精心优化的、开发出本产品,专门用于分离纯化这两种膜蛋白。它具有下列特点:
1.两步法提取,先纯化含膜组分,再分离附着型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。
2.膜蛋白(附着型+嵌入型)产量高,对肝脏组织而言,其线粒体膜蛋白产率为10 ug/mg左右,过氧化物酶体为1 ug/mg左右,内质网为25-30ug/ mgo
3.所得的膜蛋白大部分具有生物活性,可用于活性研究。
4.可用动物、植物培养细胞和实体细胞为材料,也可用预先纯化的含膜组分或细胞器(如线粒体、叶绿体、内质网、过氧化物酶体)为材料(本试剂盒不含纯化细胞器的试剂)。
5.本方法重复性好。
6.本试剂盒足够50次微量提取,分A型和B型两种。A型用于附着型膜蛋白,B型用于嵌合型膜蛋白和附着型膜蛋白。
规格及成分
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运输及保存 常温运输及保存,有效期一年。
自备试剂 PBS,电泳上样液。
使用方法
1、对培养细胞:收集1×107个培养细胞(动物细胞、植物细胞),用20 mL自备的冰浴的PBS洗涤三次,每次洗涤后需要4℃下1000g离心2分钟,然后小心弃上清。对实体组织:由于各种动植物的各种实体组织的属性差别太大,故本手册的纯化膜组分的操作步骤(第1-7步)不一定完全适合,用户需要自行优化以纯化含膜组分或含膜的细胞器(如细胞质膜、内质网、线粒体、叶绿体等),再将含膜组分或细胞器沉淀直接用于第8步的膜蛋白提取。
2、将洗涤后的细胞沉淀重悬在2 mL溶液A中,冰上静置10分钟。注意:膜蛋白有膜的保护,在纯化过程中对蛋白酶的降解没有胞浆蛋白敏感,一般可以不加蛋白酶抑制剂。但如果纯化的膜蛋白的确有降解的话,可以在溶液A中加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。
3、转移到容积为2 mL的 Dounce玻璃匀浆器上下匀浆20-50 次(具体次数取决于细胞种类,293T细胞一般需要20次左右,而MEF细胞一般需要5O次左右。最好用样品先进行预实验以摸索最佳匀浆次数,最佳匀浆次数时在显微镜下能看见细胞破裂但细胞核完整)。
4、将匀浆液转移到15或50 mL塑料管中,加入相当于匀浆液体积1/10的溶液B,其间可以轻柔颠倒混匀3-5次,留少量样品作为对照1(勾浆液)。
5、4℃ 2500 rpm离心20分钟,沉淀为细胞核,上清为胞浆和膜成分,留少量样品作为对照2(胞浆和膜成分)。
6、将上清液用Beckman Optima台式超速离心机100,000 g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该为100,000g,否则有可能得不到膜成分沉淀。
7、小心转移上清(胞浆部分)并留少量样品作为对照3(胞浆)。
8、将沉淀(含膜组分)重悬于1 mL冰浴的溶液C中后,冰上静置30分钟,留少量样品作为对照4(膜成分)。本成分电泳前,需要先用自备的TCA沉淀(TCA终浓度为10%),再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在1×上样液中待用。对照1-3号不需要这样的预处理。
9、用Beckman Optima台式超速离心机 100,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机,但离心力应该一致,否则有可能得不到沉淀。
10、如果需要附着型膜蛋白,则取上清(含附着型膜蛋白)弃沉淀(含膜和其中的嵌合型膜蛋白)。上清可以放-20℃长期保存,如果需要电泳,需要先用自备的TCA沉淀(TCA终浓度为10%),再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在1×上样液中与对照1-4号一起上样电泳。
11、如果需要嵌合型膜蛋白,则取出上清(含附着型膜蛋白)并留少量样品作为附着型膜蛋白样品,然后再用1 mL 冰浴的溶液C重悬沉淀,然后100,00og 4℃离心60分钟,去掉上清(上清含残留的附着型膜蛋白,可以留样作为洗涤后的附着型膜蛋白样品)。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋白。如果需要测定膜蛋白的浓度,则将其溶解在自备的0.5 M NaOH溶液
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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