一站式MBP标签蛋白纯化套装

一站式MBP标签蛋白纯化套装

产品及特点 MBP（麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein）标签蛋白大小为 40kDa，由大肠杆菌 K12 的 malE 基因编码。MBP 可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP 可以融合在蛋白的 N 端或 C 端。MBP 融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用 10 mM 麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除 MBP 融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用 MBP 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测 MBP 标签标记的重组蛋白。由于 MBP 融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中 MBP 常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化 MBP 融合蛋白的试剂盒，它具有下列特点：
1. 一站式套装，含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
2. 提供 2 mL 直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为 10 mg MBP 蛋白/mL介质。
3. 采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。

4. 本试剂盒足够 20 次制备，但介质可以反复使用更多次（需要复活）。

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存，但介质需 4℃保存，PMSF 需要-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 去离子水、20%乙醇、0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜
使用方法

1. 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据 MBP 蛋白产量决定，其最大载量为 10 mg MBP蛋白/mL 介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中）。
2. 用 5 倍柱体积（柱体积指的是填料介质的体积，下同，本试剂盒介质的体积是 2mL）自备去离子水洗柱，共 3 次。
3. 用 5 倍柱体积（约 10mL）的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下（以 10 mL 为例）：

4. 4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清，将细胞沉淀（约100 mg）悬于 2 mL 冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000 g 离心 15 分钟收集细胞沉淀后，再次悬于 2 mL 冰冷的细胞洗涤液中。（最好用不加诱导物的菌液做对照样。）细胞洗涤液的配方如下（以 10 mL 为例）：

5. 制备细胞裂解物：
1) 如果所用载体不带 MBP 信号肽序列（如 pMAL-c2）
a) 超声破碎细胞，功率 30 W，保持细胞低温（0℃），直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。（超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。）
b) 为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入 35 uL PMSF（10mg/mL）。
c) 4℃下 13000-15000 g 离心 30 分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化 MBP 融合蛋白，直接进入第 6 步。
2) 如果所用载体带 MBP 信号肽序列（如 pMAL-p2）
a) 4℃ 5000 g 离心 15 分钟收集细胞，沉淀悬于 1 mL 冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下（以 10 mL 为例）：

 b) 加入 25 uL PMSF（10 mg/mL），室温搅动 15 分钟，于 4℃13000-15000 g 离心 10 分钟收集细胞。
c) 旋动细胞沉淀，加入 2 mL 冰冷的 0.1 mM MgCl2溶液，4℃搅动10 分钟。
d) 休克细胞 4℃ 13000-15000 g 离心 10 分钟，在上清中加入 10mM Tris-HCl（pH 7.4）（可将 1 M Tris-HCl，pH 7.4 稀释 100倍配制而成）至 pH 为 7.4。
e) 上清用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤，滤液用 100 倍体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（配方如上）4℃透析。
f) 收集透析后样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化 MBP 融合蛋白，直接进入第 6 步。
6. 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中（保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
7. 用 10-15 倍柱体积的结合缓冲液（配方见上表）进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
8. 使用 5-10 倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液（即目的蛋白组分）。麦芽糖洗脱液的配方如下（以 10 mL 为例）：

 9. 将纯化得到的样品（包括流出液、洗杂液和洗脱液）以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。
10. 填料介质清洗：依次使用 3 倍柱体积的结合缓冲液和 5 倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用 5 倍柱体积的 20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的 20%的乙醇中，置于 4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。 

蛋白酶切割释放靶蛋白（可选步骤，所用试剂需自备）
11. 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1) 加入自备的凝血酶、肠激酶或 Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择）。每毫升介质中加入 50 单位的溶于 1 mL PBS 溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡 2-16 小时。
2) 4℃以 500 g 离心 5 分钟，上清小心转移到新离心管中。
3) 用传统的层析方法或 SDS-PAGE 电泳分离靶蛋白和蛋白酶。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！