一站式GST标记蛋白质微量纯化套装

一站式GST标记蛋白质微量纯化套装

原理及特点 重组蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 转移酶（Glutathione S Transferase） 能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层 析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽 洗脱的特点而建立，是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。本产品就是 专门用于上述目的，具有下列特点：

1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达 GST 标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。

2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达 95%的 GST-标记蛋白。

3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的 GST 标记蛋白。

4. 每次可以处理 20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。

5. 提供 4 mL 浓度为 50%的谷胱甘肽-Agarose 介质，可吸附 5-10 mg GST 标记蛋白质。

6. 本介质可以反复使用多次。

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存，谷胱甘肽-琼脂糖介质需常温运输 4℃保存，溶菌酶、 Benzonase 和 PMSF 需低温运输，-20℃保存。有效期一年

自备试剂 超纯水

使用方法

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养 20 mL 含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8。

2. 加 IPTG 到终浓度为 0.1 mM，30℃振荡培养 3 小时或 22℃振荡培养 8 小 时（或过夜）。

3. 4℃ 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清。

4. 用 1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心 10 分钟，弃上清。沉 淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释 本试剂盒提供的 10×PBS 缓冲液而得。PBS 缓冲液极其容易长细菌，注意 防止污染。

二：细胞裂解

5. 如果用超声波破碎细胞，先用 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌 沉淀（细胞裂解液的配制方法：在 1 mL 1×PBS 缓冲液中加入 50 uL 溶液 A 和 50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液，混匀即可）。冰上超声裂解重悬菌 体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸 索，一般选 1K-10K 频率处理 15 次，每次 20 秒，间隔 1 分钟（必需放置 在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6. 如果用酶法破裂细胞，则在 1 mL 冰浴的、新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌 （细胞裂解液配制方法：在 1 mL 1×PBS 缓冲液中加入 1.5 mg 溶菌酶干 粉、50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 5 uL Benzonase 溶液，混匀即可）。 将重悬细菌冰上放置 30 分钟，得到细菌裂解物。

7. 将超声或酶法得到的细胞裂解物在 13000 g 4℃离心 10 分钟去除未裂解细 胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。预留少 量（如 100uL）作为裂解液留样，其余用于第 10 步的过柱。

三：层析柱的制备和 GST 蛋白纯化

8. 摇晃将 4mL 谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，全部加入到预放了一片筛板 的层析柱中（介质的最低用量需要根据 GST 蛋白产量决定，100 mL 菌液 最少需要使用 200 uL 介质。此处加 2mL 则绰绰有余）。下列步骤各溶液的 用量均针对 4mL 介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9. 用 40 mL 预冷的 1×PBS 缓冲液洗柱。

10.将第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 标记蛋白）上柱，让重力使上柱液 自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间 的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分钟即可。如要提高 GST 标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒 提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11.用 10 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）并预留 100uL 作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。

12.用 0.2-0.5 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的 GST 标记蛋白样品。GST 洗脱液的配制方法是将约 80mg GST 洗脱液成分 二干粉全部加入到 GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶 污染，所以纯化样品不能在 4℃长期放置，需留 100uL 左右用于后续浓度 测定或/和 SDS-PAGE 电泳，其余放-80℃长期放置。

13.用裂解液留样（第 7 步）、穿透液留样（第 11 步）和纯化样品留样（第 12 步）进行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。注意：本操作没有预先脱盐， 故只能用 Bradford 法或 OD 检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留 样的蛋白浓度。按 OD 检测法，1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于 GST 的分子量为 26 KD，所以在 SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天 然蛋白大 26 KD。

附：GST 柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1. 用 3 倍介质体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。介质为 2mL 则用 6mL， 下同。

2. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3. 用 3 倍介质体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处 理柱子 10 分钟。

4. 用 3 倍介质体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处 理柱子 10 分钟。

5. 再重复 3-4 步两次。

6. 用 3 倍介质体积的超纯水处理柱子 3 次。

7. 若需要立即使用，则用 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。堵 上漏口，加 3 倍介质体积的 1×PBS 缓冲液洗涤后立即使用。

8. 若长时间不用，则上步的 1×PBS 改成 20%的乙醇，其余操作完全相同。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！