植物线粒体总蛋白提取试剂盒
产品及特点 植物线粒体是重要的植物细胞器,负责 ATP 的产生。此外植物很多重要的特性(如 雄性不育)也跟线粒体相关,是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗 传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体总蛋白提取的试 剂盒,它具有下列特点:
1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。
2. 线粒体提取部分提供粗提和精提两种操作方案,粗提利用常规台式冷冻离心机的 差速分离原理进行线粒体粗提,所得线粒体含少量其他细胞器污染,可用于后续 的 SDS-PAGE,Western,ELSIA 和蛋白组分析,也可以用于 PCR 级别的线粒 体 DNA 和 RNA 提取。
3. 精提利用冷冻超速离心(离心力达 40000g)制备的密度梯度来将粗提制备的线 粒体和其他细胞成分进一步分开,得到线粒体精提液,适用于后续的偶联分析、 体 外 线 粒 体 蛋 白 合 成 、 线 粒 体 成 份 定 位 等 精 细 实 验 。 也 可 用 于 后 续 的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体 DNA 和 RNA 提取。
4. 本产品足够 5 次提取,每次可处理 10g 绿色植物组织(可得 1-2.5 mg 左右线粒 体)或 20g 非绿色植物组织(可得 2-5 mg 左右的线粒体)。
5. 采用温和的中性裂解成分,蛋白保持天然活性。
6. 得到的提取物可以直接用于 SDS-PAGE、2D 电泳、免疫印迹分析、蛋白活性 测定和 BCA 法及 Lowry 法蛋白定量(不适用于 Bradford 法)。
规格及成分
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运输及保存 低温运输, 植物线粒体总蛋白提取溶液 A和B -20℃保存,保存期限一年。
自备试剂 超纯水,可能需要 5 M KOH 调 pH,如果需要去除细胞核 DNA,还需要自备 25mM MgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、DNase 干粉和另购更多植物线粒体提取洗涤液。
使用方法 注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用植 物组织,器皿和溶液均需要在 4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过 4℃。
一:选择组织 1. 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:1. 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:
![](https://img1.17img.cn/17img/images/202209/uepic/f4571dc1-6e85-41f4-a697-086196fa4950.jpg)
2. 一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片),需将植物提前放在暗 室至少 3 天以降低淀粉含量,否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3. 一次实验需要 40 mL 植物线粒体提取匀浆液、约 90 mL 植物线粒体提取洗涤液 和 35 mL 密度梯度离心介质(配制方式是一次性将 9.8g (8.7mL) Percoll 加入 到 26.3mL 植物线粒体提取离心介质溶液中,充分混匀后得到 35mL 密度梯度 离心介质)。这三种溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其终浓度为 0.1%(100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉,轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用)。每次 实验用多少配多少,不要预先将所有 BSA 干粉加入,否则容易长菌。
二:线粒体粗提操作流程
1. 将 10 g 的绿色植物组织(如去叶脉后的嫩叶子,愈伤组织)或 20 g 干净的非绿 色植物组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中 10 分钟,用纸吸干液体 后浸泡在预冷的 40 mL 植物线粒体提取匀浆液(需先加 0.1% BSA)中,在浸 泡状态下剪成 1cm2大小的碎片。注意:如果样品可分成多组平行处理,得到线 粒体粗提物后再汇集,否则线粒体产率将急剧降低。
2. 将植物线粒体提取匀浆液和其中的植物组织碎片转移到 Waring 匀浆器中,中速 匀浆 3 次,每次 15 秒,每次之间间隔 10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也 可使用研磨法。具体操作是将植物线粒体提取匀浆液和其中的植物组织碎片转移 到预冷的研钵中,研磨 3-4 分钟。注意:植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液 酸化,降低 pH,而线粒体对 pH 变化非常敏感,因此建议匀浆后用 pH 试纸检 测匀浆液的 pH,如果低于 7.0,必须用自备的 5 M KOH 将 pH 调到 7.0 以上 才进入下一步。
3. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液,穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的 50 mL 的塑 料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4. 在低速固定角度冷冻离心机上 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,沉淀为未破碎的细胞、 破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒,上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷 的 50mL 塑料离心管中。
5. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上 4℃ 12,000 g 离心 20 分钟,弃上清液, 所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀, 属于正常现象。
6. 加入 10 mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液(需先加 0.1% BSA,下同)中,用 软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀,需要避免重悬之)。不 能剧烈震荡,否则线粒体容易破裂。
7. 将线粒体重悬液转移到新的 50mL 离心管中,再加入 30mL 预冷的植物线粒体 提取洗涤液(终体积为 40 mL)中,4℃ 1000 g 离心 5 分钟。线粒体将在上清 中。
8. 将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000 g 离心 20 分钟,沉淀为 线粒体。小心弃上清。到此步时,线粒体回收率一般在 15-30%。
9. 在沉淀中加入 2 mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液。用软毛笔轻柔重悬,得到线 粒体粗提液。如果有平行提取,可将最多 4 管线粒体沉淀重悬在 2 mL 植物线粒 体提取洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在 45-75%。
10. 所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体, 乙醛酸循 环体,或细菌)污染,但可直接用于 PCR 级线粒体 DNA 和 RNA 的提取、呼吸链 功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存,则可以在线粒体重 悬液中加入 1/20 体积的自备 DMSO,混匀后分成 0.5 mL/管,然后放-80℃保 存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三:细胞核 DNA 的去除(纯化测序级的线粒体 DNA 才需要进行此操作。本产品不 提供相关试剂,实验步骤仅供参考)
11. 预留 50uL 线粒体粗提液做对照,在约 2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入 40 uL 25mM 的 MgCl2,再加入 200ug DNase 干粉或溶液(总量为 200ug 即可), 混匀后冰上放置 60 分钟降解 DNA。取少量样品(如 50uL)在 PCR 仪器中加 热到 95℃变性 10 分钟灭活 DNase,再取其中的 10uL 和 10uL 预留的样品一 起进行细胞核基因专一性 PCR,如果 DNase 处理的样品没有扩增,而预留样品 有扩增,则表明 DNA 去除比较干净(达到 PCR 检测的极限),则进入下一步。 如果未去除干净,则继续在冰上放置,直到 PCR 检测不到细胞核 DNA。
12. 加入 0.32 mL 预冷的自备 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 预冷的植物线粒体提取 洗涤液。
13. 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000 g 离心 20 分钟,沉淀为去除细胞核 DNA 的线粒体。重悬在 2mL 植物线粒体提 取洗涤液中。
四:线粒体精提操作方案(需要 40000g 的超速冷冻离心机)
14. 在 50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入 35 mL 预冷的密度梯度离心介质(配制 方法见第三步,用前需先加 0.1% BSA)。
15. 将 2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16. 在超速水平离心机上 4℃ 40,000 g 离心 45 分钟,最上层为黄色或橙色的质体 带(如果材料是绿色植物,此带将是绿色),其下的白色不透明的带即为线粒体, 管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下
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17. 用广口吸管(可将 1 mL 蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带,注意避开其上 的质体带过氧化物酶体沉淀,估计所取含线粒体溶液的体积。
18. 在 15-20 分钟的时间内缓慢加入至少 4 倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液。
19. 转入 50 mL 塑料管离心管中,在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟,沉 淀为线粒体。
20. 将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少 4 倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液 中,在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟,弃上清,沉淀即为洗涤后的 线粒体精提物。到此步时,线粒体回收率一般在 5-15%。
21. 将精提的线粒体重悬在 1mL 预冷的植物线粒体提取洗涤液中。重悬的线粒体可 以立即使用,在冰上最多可放置 5-6 小时。如果需要长期保存,则可以在线粒体 重悬液中加入 1/20 体积的 DMSO,混匀后分成 0.5 mL/管,然后放-80℃保存。 如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五:线粒体总蛋白提取
22. 每 10mg 湿重线粒体沉淀加入 0.5 mL 植物线粒体总蛋白提取溶液 A 和 50μL 植物线粒体总蛋白提取溶液 B,吹打混匀。 23. 冰上放置 30 min 至 1h。
24. 4℃ 12,000 g 离心 1 min。
25. 将上清液转移至一新的 1.5 mL 塑料离心管中即得到蛋白溶液,可置于 -70℃冰箱保存或立即使用。如果要进行 SDS-PAGE 电泳,可取部分样品 到离心管中,加入 5×SDS-PAGE 上样缓冲液(终浓度为 1×),在沸水中 处理 5 min 后立即上样电泳。其他功能检测:请自备方法。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
植物线粒体总蛋白提取试剂盒信息由上海博尔森生物科技有限公司为您提供,如您想了解更多关于植物线粒体总蛋白提取试剂盒报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。除供应植物线粒体总蛋白提取试剂盒外,上海博尔森生物科技有限公司还可为您提供牛血清γ球蛋白(BGG)标准品、免疫蛋白清除剂、RIPA裂解液(弱强度)等产品,公司有专业的客户服务团队,是您值得信赖的合作伙伴。