碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060405190413073](https://shxybio.net/upload/ueditor/image/20220604/2022060405190413073.png)
产品说明:
AKP 是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类,属于丝氨酸蛋白酶。此外,该酶还能够水解酯键、酰胺键,具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一,广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。在碱性条件下,AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝;钨蓝在 680nm 有特征吸收峰,测定 680nm 吸光度增加速率,来计算 AKP 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5mL EP 管、冰 和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称约0.1g组织,加入1mL提取液,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心10min,取上清,即粗酶液,置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品,加入1mL提取液,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min 以上,调节波长至680nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
3、 标准溶液的配制:临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL 标准溶液使用,现用现配。
4、 样本测定:(1.5mLEP管中分别加入下列试剂)
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三、碱性蛋白酶活性计算
1、按蛋白浓度计算
酶活单位定义:40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1 μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性(U/mg prot)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(Cpr×V2)÷T=0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活单位定义:40℃每克样本每分钟催化水解产生 1 μmol 酪氨酸为一个酶活单位。
AKP 活性(U/g 质量)=C 标准品×ΔA 测定÷ΔA 标准×V1÷(W×V2÷V3)÷T=0.125×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
C 标准品:0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液; Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; V1:酶促反应总体积,0.5mL;V2:加入反应体系中粗酶液体积,0.1 mL;V3:粗酶液总体积,1mL;T:催化反应时间,10min。
注意事项:
若反应较弱,(A 测定管-A 对照管)差值较小,可适当延长反应时间(20-30min),即第一步水浴时间,最后计算酶活时对公式进行修改。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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