3-磷酸甘油酸激酶(PGK)检测试剂盒 紫外分光光度法

3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解后待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2、 试剂三：临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

5、 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起 340nm 处的吸光度下降，即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

血清/血浆：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：(在1mL石英比色皿分别加入下列试剂)

注意事项：

1. ΔA 大于 0.8 或者 A1 测定小于 0.9 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（10min 或 15min）或增加样本体积来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

实验实例：

1、 取 0.1g 白菜加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释 4 倍，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.126-0.654=0.472，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.472-0.002=0.47，按样本质量计算酶活得：PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.47÷0.1×4=6044.952 U/g 质量。

2、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释 20 倍，之后按照测定步骤操作，测得计算，ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.908-0.35=0.558，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.558-0.002=0.556，按样本质量计算酶活得：

PGK（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×稀释倍数= 321.54×0.556÷0.1×20=35755. 248 U/g 质量。

3、 取骆驼血清样本 100uL 按照测定步骤直接测定，测得计算，ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定= 0.966-0.907=0.059，ΔA空白管=A1 空白-A2 空白=0.916-0.914=0.002，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.059-0.002=0.057，按液体体积计算酶活得：

PGK（U/mL）=321.54×ΔA=321.54×0.057=18.328 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！