DHE-ROS活性氧检测试剂盒-红色荧光

产品概述

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 DHE活性氧（ROS）检测试剂盒是一种利用荧光探针DHE(Dihydroethidium)进行活性氧检测的试剂盒。DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的培养细胞中ROS经典检测方法。 在激发波长535nm，发射波长610 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。 O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的红色荧光探针，还可以提供蓝色、绿色、深红色荧光的活性氧检测试剂盒。 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。 可以为您提供各种绿色、红色、蓝色、深红色的活性氧/活性氮检测试剂盒产品。 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。 可以为您提供各种细胞成像、细胞示踪与追踪试剂盒产品。包括各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品，以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。 可以提供各种细胞、组织染色，免疫组织化学，细胞培养等相关试剂盒产品。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.避免反复冻融。

2.可以根据需要分装后冻存。

3.探针为DMSO溶液，在2-8℃时是固体状态，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

有效期

6个月

检测方法

1.流式细胞仪2.荧光显微镜3.激光共聚焦

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品特点

1.使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

仪器准备

1.激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.黑色96孔板

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

5.对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，可以先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用相应的药物刺激细胞，后标记探针。注意避免具有氧化还原性的药物与探针反应。

6.DHE在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。

7.对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。

使用方法

DHE探针配制：

1. DHE探针可在新鲜无血清培养基、各种缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，1000-10000倍稀释，以此染色工作液更换细胞培养基；也可直接向细胞培养基中加入DHE探针溶液至所需浓度。

2. 依据细胞ROS含量的不同，DHE终浓度可选择在1000-10000倍稀释的范围，孵育时间可选择10-90 分钟，在37℃或室温进行避光孵育。

DHE探针标记：

原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。

1. 按照1:1000-2000用无血清培养基稀释DHE探针。

2. 去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。

3. 加入适当体积稀释好的 DHE探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于96孔板每孔加入100-200μl染色液，六孔板的一个孔加入稀释好的DHE探针不少于1毫升。

4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育10-60分钟。

5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DHE探针。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1. 按照1:1000用无血清培养基稀释DHE探针。

2. 离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。

3. 细胞收集后悬浮于稀释好的DHE探针中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内避光孵育10-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DHE探针。

5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。

荧光显微镜检测：

1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

2. 对贴壁生长细胞，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。

3. 荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出蓝色荧光。

4. 实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

5. 荧光强度强，活性氧含量高。

流式细胞仪分析：

1. 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1 ml冰冷PBS重悬细胞（5~10万）。收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2. 采用480~535 nm波长激发，测定590 nm~610 nm以上的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS阳性细胞有较强的红色荧光。

3. 检测刺激前后荧光的强弱。

4. 荧光强度强，活性氧含量高。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！