文献导读| 影响纳米颗粒跟踪分析技术的关键参数——标准操作流程的建立

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近日，中国科学院上海药物研究所于International Journal of Pharmaceutics上发表题为“纳米材料大小和浓度的关键参数以标准化纳米颗粒跟踪分析”的文章。该项研究中，作者系统性地评估了包括样品构成，样品浓度，仪器设置参数，相机设置参数，液体流速对于NTA (NanoSight NS300) 测量准确性的影响。在研究过程中，他们同时选取了颗粒粒径表征的金标准——透射电子显微镜及基于电阻脉冲感应 (RPS) 原理的NanoCoulter纳米库尔特粒度分析仪进行正交实验，交叉验证NTA对颗粒粒径及浓度测量的精度。

具体来说，作者系统性地评估了样品浓度、相机曝光度、进样泵流速对NTA测试效果的影响。

比较不同颗粒浓度下测量结果的准确性

‍‍图1样品浓度对NTA测量结果的影响。‍

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‍‍作者使用了不同大小的聚苯乙烯 (PS) 和二氧化硅 (SiO2)标准颗粒，在不同的粒子浓度下进行了测量，并比较了不同浓度下的平均尺寸和浓度偏差。结果显示，‍当粒子浓度在10⁸-10⁹ particles/mL之间时，测量结果最为准确，线性趋势最好。此时对应视野内的颗粒数为10-100和400-6500个。

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比较不同曝光度对测量结果的影响

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图2. 曝光度‍‍对‍NTA测量结果的影响

‍‍‍‍与DLS不同，NTA通过相机追踪颗粒的实时的布朗运动进行颗粒粒径计算。因此优化相机设置参数可以显著提高NTA‍测得的粒径和浓度的准确性。作者使用了混合的不同尺寸的PS颗粒，在不同的曝光度 (camera level) 下进行了表征。曝光度是表明相机对颗粒运动敏感程度的参数。通过调节曝光度，可以影响NTA的拍照结果。结果显示，在曝光度为6-9时，100 nm的PS颗粒观测不佳，而200 nm的PS颗粒清晰可见，当曝光度为10-14时，100 nm的PS颗粒可以清晰地被观测到，而200 nm的PS颗粒会过曝，影响结果。随后作者进一步评估了曝光度对100 nm，120 nm，150 nm，170 nm和200 nm的PS颗粒的粒径峰值及分布进行了表征。结果表明，曝光度变化并未显著影响PS颗粒的粒径峰值，但是随着曝光度上升，各组PS颗粒的粒径平均值上升。因此作者认为具体的不同大小的颗粒会与曝光度共同影响粒径的测量结果。当样本分散度较大时，NTA相机难以找到合适的曝光度以保证可以拍到所有颗粒。在撰写相关报告的时候，需要将NTA的曝光度等设定参数一并提交，以保证数据透明性。

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比较不同不同泵速对测量结果的影响

‍‍之前的研究已经表明，溶液粘度会影响NTA测量结果的‍‍准确性，但是对于泵速对测量结果有何影响仍是未知，因此作者使用了不同大小的PS颗粒，在不同的泵速下进行了测量，并比较了不同速度下的平均尺寸和浓度偏差。结果显示，对于小于200 nm的颗粒，泵速在50 AU (arbitrary unit)以内可以得到较为准确的结果，而对于更大的颗粒，则需要更低的泵速才能保证准确性。

图4. N‍TA、DLS和RPS对多分散样本的测量影响

随‍后基于这些结果，作者按照该标准操作流程，评估了NTA对于多分散样品的表征能力。作者制备了1: 1和10: 1（浓度比）的100 nm和150 nm PS颗粒混合物，根据不同的曝光度，NTA在7-10的范围内对两个样品都可以顺利测量得出两个粒径峰位。随后，作者进一步制备了1: 1: 1的100 nm，150 nm和200 nm及1: 1: 1: 1的100 nm，150 nm，170 nm和200 nm的三混合和四混合样本，结果表明NTA无法完成测量，仅能得出一个宽峰。随后作者进一步使用DLS和RPS对上述四个样本进行分析，DLS对于上述四个样本都无法测量得到精确峰位，仅能得到一个单峰，而基于RPS理论的NanoCoulter‍‍通过单颗粒检测手段，成功地测量出混合物的粒径，并得出精确峰位。随后作者进一步验证了RPS的粒径测量效果，制备了浓度比为‍1: 1: 1: 1的80 nm，120 nm，160 nm和200 nm的混合物。测量结果再次证实RPS可以顺利地将混合物测出对应的峰，并且不同的样品峰之间区分明显，分辨率良好。这种四分布样品可以更真实的代表实际样品。

最后，作者选取了两种外泌体（分别来源于HEK293细胞和干姜），分别使用NTA，DLS和RPS技术进行粒径分析。结果表明在粒径分析方面，NTA所得到的数据与TEM相似，而DLS粒径值偏大，RPS所得粒径结果偏小。在浓度方面，RPS表现出更精确的定量分析能力，这得益于RPS的单颗粒检测技术，可以对每一个颗粒实现精确表征。

通过对实际样品的测量，作者归纳总结了四种不同的颗粒表征方法的特点（表1）。作者认为NTA在颗粒粒径分析方面具有良好的分辨率和高准确性，可以区分2-3‍种模态的样本，但是对于外泌体类的样本，NTA无法分辨外泌体，囊泡和脂蛋白，同时NTA也无法对不同来源的外泌体进行区分。对于DLS，作者认为该方法十分简便，微量样本即可完成测量，但是该方法测得的粒径值与真实情况相比偏差较大，并且该方法无法测量样品颗粒浓度。TEM方法则可以直接实现样本颗粒的可视化测量，但是该方法成本高昂，费时费力。对于RPS，作者认为该方法可以直接测量颗粒真实粒径（尤其是未知样本的颗粒特征情况下），并对多模态的混合样本有良好的分辨率。

‍‍表1. ‍‍四种不同粒径分析方法的特点汇总‍

‍‍‍‍通过该工作，作者系统的评估了包括浓度，仪器阈值，曝光度，泵流速等因素对NTA性能的影响，他们发现在浓度为10⁸~10⁹，泵流速为50AU时，对于颗粒样本可以得到较为精确的表征结果，同时，他们也提出对‍于仪器阈值及曝光度这两个参数，则需要结合样本的粒径具体问题具体分析。同时，他们也发现NTA对于多分散样品分析能力不佳，而RPS则可以成功的区分三峰或四峰样品，表明RPS对于多分散样本具有更优异的区分能力。同时作者选用多种表征手段对两种外泌体进行了分析，各个表征手段所得到的粒径与浓度并不相同，因此作者认为在进行生物学颗粒研究时，需要运用正交方法学对颗粒进行多重表征。
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参考文献