一、研究方法
选择三种受人类活动影响程度不同的土壤,去除土壤原有水分后,使用美罗培南、环丙沙星、头孢噻肟三种抗生素和重水与土壤共孵育24h。通过碘海醇梯度离心法提取全部土壤菌,然后在拉曼光谱仪下检测并统计重水标记峰。接着,利用PRECI SCS微生物单细胞分选仪免培养分离高耐药活性菌,最后进行宏基因组确定其对应的耐药基因。
在该过程中,PRECI SCS微生物单细胞分选仪分离活性菌的过程仅需3步即可实现。
1)将经过拉曼检测的样品芯片放置到分选仪上,并放置细胞接收器,用于接收分离细胞。
2)在PRECI SCS微生物单细胞分选仪的镜下视野中选择之前拉曼检测中呈现高CD ratio的活性耐药菌。
3)调整分选激光的合适参数,点击分选,将细胞分选至接收器中。
二、研究结果
活性耐药菌代谢D2O到体内后会代替部分C-H键为C-D键,在拉曼光谱上体现为C-H峰红移,产生C-D峰。计算C-D峰与C-D峰和C-H峰的比值(CD ratio),作为土壤菌活性标准,统计每个样品中的菌活性能够看出,三种抗生素孵育结果均表明人类活动影响下土壤耐药菌活性更高。
上述含有C-D峰的活性耐药菌经过CD ratio的计算排序之后,选择了前2%进行单细胞分离(图4红色光谱部分)。
分离的单细胞经扩增后用于宏基因组检测。结果显示放线菌门、变形菌门和厚壁菌门是土壤中活性耐药菌的优势菌门(图5右),共包含31个种,这类具有活性的耐药菌在未筛选前的土壤中仅占一小部分(图5左),这说明抗生素筛选联合Raman-D2O进行单细胞分离过程对土壤活性耐药菌的检出是十分必要的。
参考文献:
[1] Li, H. Z., Yang, K., Liao, H., Lassen, S. B., Su, J. Q., Zhang, X., Cui, L., & Zhu, Y. G. Active antibiotic resistome in soils unraveled by single-cell isotope probing and targeted metagenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119, e2201473119 (2022).
为什么选择PRECI SCS微生物单细胞分选仪?
过去的单细胞分选通常采用流式技术,一般需要复杂的前处理步骤和标记要求,对于环境微生物的探究,在基因未知情况下难以准确锁定功能菌或耐药菌。PRECI SCS微生物单细胞分选仪是基于激光诱导向前转移(LIFT)技术开发的一款针对微生物单细胞进行分选的设备,可在显微视野下直观、可视化地识别目标细胞,并将其精准分选出来。该方法操作简单,无需复杂前处理,且能应对土壤等复杂环境样品中杂质干扰等问题,对操作者的技术要求更低,适用范围更广。
环境中未培养微生物的数量远超可培养微生物,而对于未培养微生物的功能表型与基因型的探究,还需要更为直观、准确的工具。PRECI SCS微生物单细胞分选仪联合宏基因测序技术,为微生物的靶向宏基因分析提供了切实可行的策略,有助于进一步揭示未培养微生物在生态系统中的作用与功能。
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