自动菌落计数仪在食品中大肠菌群检测的应用(平板计数法）

自动菌落计数仪在食品中大肠菌群检测的应用(平板计数法）

方案摘要：在一定培养条件下能发酵乳糖，产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。本方法利用自动菌落计数仪可达到快速计数食品中大肠菌群的数量。

方案详情：

1、 实验原理

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落，通过自动菌落计数仪可快速得到大肠菌群结果。

2、 实验准备

1、设配和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

① 恒温培养箱:36 ℃ ±1℃。

② 冰箱:2 ℃~5 ℃。

③ 恒温水浴箱:46℃±1℃。

④ 天平:感量 0.1 g。

⑤ 均质器。

⑥ 振荡器。

⑦ 无菌吸管:1 mL(具 0.01 ml 刻度)、10 mL(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸头。

⑧ 无菌锥形瓶:容量 500 mL。

⑨ 无菌培养皿:直径 90 mm。

⑩ pH计或pH比色管或精密pH试纸。

⑪ 自动菌落计数仪SHASHIN KAGAKU，PSF-2100。

⑫ 蠕动泵分液器：fluidot  600D

⑬电动移液器  pipetty 10mL

2、培养基和试剂

① 月桂基硫酸盐胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose,LST)肉汤。

② 煌绿乳糖胆盐( brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤。

③ 结晶紫中性红胆盐琼脂( violet red bile agar，VRBA)。

④ 无菌磷酸盐缓冲液。

⑤ 无菌生理盐水。

⑥ 1 mol/L NaOH 溶液。

⑦ 1 mol/L HCl溶液。

三、检验程序

1、大肠菌群平板计数法的检验程序如下：

四、实验步骤

4.1 样品稀释

4.1.1 固体和半固体样品:称取 25g样品,放入盛有 225 ml,磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min,或放人盛有 225 ml,磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10 的样品匀液。

4.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL,样品置盛有 225 ml,磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1:10 的样品匀液。

4.1.3 样品匀液的pH应在 6.5~7.5之间,必要时分别用1 mol/l, NaOH 或1 mol/L HCl调节。

4.1.4 用1ml, 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml,沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1 ml,无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。

4.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml,无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。

4.2 平板计数

4.2.1 选取2个~3 个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1ml。同时取1 ml生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

4.2.2 及时将 15 mL~20 ml,融化并恒温至 46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h。

4.3 平板菌落数的选择

4.3.1 选取菌落数在15 CFU~150 CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm或更大,最低稀释度平板低于15 CFU 的记录具体菌落数。

4.4 证实试验

4.4.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃士1℃培养 24h~48 h,观察产气情况。凡 BGLB肉汤管产气即可报告为大肠菌群阳性。

五、结果及报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-'样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100x6/10X10'/g(mL)=6.0X10’CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。