利用外水合层的同型二元组方法开发具有高稳定性和水溶性的NIR-II光学探针通过注射或喷涂成像

本文要点：具有扩展共轭结构的染料是研究者进行设计和合成的重点，旨在进一步提高并赋予染料独特的光学和电子性能。这些设计使这些染料适用邻域广泛，从第二窗口近红外（NIR-II）生物成像到有机光伏。然而，大共轭的固有优势往往伴随着其他挑战，如聚集、荧光淬灭、吸收蓝移、低稳定性和水溶性差。本文介绍了一种独特的结构设计策略来解决这些问题，将这种独特的策略称为“具有外部水合层的同源二元组”，为开发具有长吸收/发射波长的成像探针量身定制。这种方法涉及通过柔性连接子将两个七亚甲基花青结合在一起，形成同二元结构，同时创新性地将四个聚乙二醇（PEG9）链连接到末端杂环上。这种方法赋予染料出色的水溶性、生物相容性，并增强了化学、光和光谱稳定性。利用这一策略，开发了一种用于NIR-II荧光和3D多光谱光声断层扫描成像的生物标志物激活探针（HD-FL-4PEG9-N），及其在疾病可视化中的有效性。由于其高水溶性，它不仅可以用作急性肾损伤成像的可注射探针，还可以用作细菌感染伤口成像的可喷雾探针。

活体成像

方案1. 发色团 HD-FL-4PEG9、探针 HD-FL-4PEG9-N 和激活探针（响应产物）HD-FL-4PEG9-NO 在探针对 NO 的响应时的化学结构。

本文提出了一种独特的结构设计策略“同二元与外部水化层方法”。这种设计复杂的方法旨在解决上述挑战，并为设计具有长吸收波长的成像探针提供了一种易于操作的策略（方案1）。该策略的核心是将两个七甲胺花青偶联，使用相对灵活的连接子产生同位二元，该连接子放大空间过度拥挤以阻止反应剂的攻击，并避免两个花青部分之间的大范围π-π堆积，从而提高化学、光和光学光谱的稳定性。这种方法的另一个方面涉及掺入四个聚（乙二醇）链（每个链包含九个重复单元的乙二醇，称为PEG9）。这些PEG9链巧妙地位于分子支架的所有四个末端，当在水中水合时，这些PEG9链在发色团支架周围形成外部水合层，因为PEG是众所周知的生物相容性和亲水性聚合物。这种配置确保了染料在水性环境中的生物相容性、高溶解度和稳定性。为了实现NIR-II光学成像，在二元组的两个中间位置引入了生物标志物响应单元。所得探针名为HD-FL-4PEG9-N，具有高水溶性、化学/光/光谱稳定性、良好的生物安全性和最少的蛋白质结合。随后，该探针在光学生物成像中用作药物诱导的急性肾损伤的注射探针和细菌感染伤口的可喷雾探针。这允许通过原位生物标志物（NO）激活的 NIR-II 荧光和光声成像来可视化和监测疾病。实验结果证实了探头优异的成像性能。

图2. HD-FL-4PEG9的光物理性质

通过微观取代法将仲胺基团引入HD-FL-4PEG9的两个介观位置，使水溶性可激活探针（HD-FL-4PEG9-N）通过NIR-II荧光成像和3D-MOST成像检测生物标志物NO。在PBS（pH = 7.4,10 mm）中测试了探针HD-FL-4PEG9-N的光谱特性和对NO的响应。在没有NO的情况下，探针HD-FL-4PEG9-N的吸收带在640nm处中心（图2A）。然而，NO的存在和NO水平的增加（NO供体：MAHMA NONOate）导致640nm处的吸收降低，并且在835nm左右出现新的吸收峰，随着NO水平的增加而逐渐增强。探头HD-FL-4PEG9-N与不同NO水平反应后的光声强度如图2B所示。相对光声强度也随着NO水平的增加而增强。图2C，D显示，对于探针HD-FL-4PEG9-N，随着NO水平的增加，荧光强度（发射峰在926 nm）在900–1200 nm范围内增强，检测限确定为0.21 μm;而在没有NO的情况下，探针的荧光几乎可以忽略不计。并且随着NO与探针之间反应时间的延长，荧光强度增强（图2E），反应达到平衡的时间小于10 min，这表明探针对NO的快速响应。此外，MALDI-TOF质谱法证实了HD-FL-4PEG9-N（探针）对NO的响应机制。在用NO（不完全反应）孵育后，在质谱图中，除了探针的m/z峰（1390.8405）外，还会出现另一个分子离子峰，该峰位于m/z 1419.8307处，与HD-FL-4PEG9-NO匹配。这证实了 HD-FL-4PEG9-NO 是由 NO 和 HD-FL-4PEG9-N 之间的反应产生的。此外，为了研究HD-FL-4PEG9-N对NO的选择性，HD-FL-4PEG9-N（探针）与各种潜在干扰物发生反应。只有NO可以诱导荧光发射或光声强度的增强，表明HD-FL-4PEG9-N对NO具有良好的选择性。如图2F所示，对于探针HD-FL-4PEG9-N或响应产物（HD-FL-4PEG9-NO，在HD-FL-4PEG9-N与NO孵育后），即使在连续激光照射60分钟后，吸光度也仅略有下降;相比之下，由于光漂白，ICG的吸光度显着降低，表明与ICG相比，探针和响应产物（活化探针）的光稳定性要高得多。这些数据支持探针HD-FL-4PEG9-N可以快速响应NO并产生光稳定响应产物HD-FL-4PEG9-NO（激活探针），从而相应地产生可用于生物成像的NIR-II荧光和光声信号。

图3. 顺铂诱导的 AKI 小鼠模型的双模式成像实验

急性肾损伤 （AKI） 是一种以肾功能迅速丧失为特征的病理疾病。在肾损伤部位，其中产生一氧化氮水平升高，进一步加重肾损伤;因此，NO可以作为原位监测肾损伤程度和恢复程度的内源性生物标志物。在本实验中，我们采用了顺铂诱导的AKI小鼠模型，该模型是根据文献报道的方法腹腔注射顺铂建立的。然后，用N-乙酰基-l-半胱氨酸（一种临床使用的抗氧化剂，可保护肾脏免受肾毒性，称为NAC）治疗模型小鼠。采用纯光学成像方法NIR-II荧光成像以及光学-超声混合成像方法多光谱光声断层扫描（MSOT）成像监测AKI的程度。光学-超声混合MSOT成像可以呈现从最大强度投影图像中获得的高分辨率正交视图3D图像，有利于利用3D MSOT图像提供的3D信息精确定位病变部位。实验过程如图3A所示。对于AKI小鼠，NIR-II荧光信号在肾脏中稳步增加，在约6小时达到峰值，然后由于肾脏代谢而减少。相反，健康小鼠（对照组）由于健康肾脏中的NO水平低，因此几乎没有荧光。值得注意的是，与没有NAC治疗的模型组相比，用NAC治疗的小鼠的荧光信号要弱得多。图3C显示，与健康小鼠（对照组）和治疗组（通过NAC治疗的模型小鼠）相比，模型组的肾脏看起来更苍白，更肿胀。此外，从图3D，E中可以明显看出，对于主要器官，模型组的肾脏显示出更强的荧光信号，并且该结果与体内NIR-II成像的数据一致。

随后，探针HD-FL-4PEG9-N被用于小鼠顺铂诱导的AKI的MSOT成像。与对照组（健康小鼠）相比，顺铂诱导的AKI小鼠肾脏中的MSOT信号逐渐增加，在约6 h时达到峰值。然而，在NAC治疗的小鼠组中，与没有NAC治疗的模型组相比，可以观察到更弱的MSOT信号。此外，在探针HD-FL-4PEG9-N静脉注射后不同时间小鼠的3D-MSOT图像显示在图3F中。很明显，与对照组（健康小鼠）或NAC治疗组相比，模型组的肾脏显示出更明显的MSOT信号。显然，这些MSOT成像数据与NIR-II荧光成像的结果一致。对每组主要器官进行MSOT成像。从图3G，H可以看出，在主要器官中，模型组肾脏中的MSOT信号最强，证实了HD-FL-4PEG9-N分子主要进入肾脏，可以通过响应其中的NO来有效检测AKI。模型组中的小鼠体重明显下降，这进一步证实了顺铂的毒性。这些结果证实了探针HD-FL-4PEG9-N确实可以在顺铂诱导的AKI小鼠中被NO有效原位激活，并且可以通过NIR-II荧光成像和MSOT成像实时评估AKI在小鼠中的严重程度和治疗结果。

皮肤是抵御有害外力的第一道防线。因此，开放性皮肤伤口极易受到细菌感染，因为它们可以作为病原体的入口。细菌感染的皮肤伤口中，一氧化氮 （NO） 过表达，可作为原位活化生物成像的内源性生物标志物。因此，为了评估探针HD-FL-4PEG9-N作为可喷雾探针的应用，我们采用了细菌感染的皮肤伤口小鼠模型。细菌感染的皮肤伤口小鼠模型是根据文献报道的方法建立的，该方法包括金黄色葡萄球菌的损伤、感染和细菌暴露程序，因为金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌，简称金黄色葡萄球菌）是最主要的病原体之一，可引起广泛的临床表现，是所有常见葡萄球菌中最危险的。实验过程如图4A所示。通过将抗菌肽Tet213（KRWWKWWRRC）（Tet213）溶液涂在皮肤伤口部位（第1、2、3、4和5天）（治疗组）来治疗细菌感染的皮肤伤口。一组未经任何治疗的健康小鼠作为对照组。探头HD-FL-4PEG9-N（2.0mg/kg）在第 3 天、第 7 天和第 12 天喷洒在皮肤伤口部位进行体内成像实验。如图4B，G所示，在第7天，在探针喷洒到伤口部位30分钟后，在模型组小鼠的伤口部位出现明显的NIR-II荧光信号。相反，在对照组中，由于NO（健康小鼠）水平低，皮肤伤口部位的荧光可以忽略不计。在治疗组（用Tet213治疗的模型小鼠）中，与模型组相比，伤口部位的荧光信号要弱得多，表明治疗后伤口部位的NO水平降低。此外，图 S38–S41（支持信息）显示了探针 HD-FL-4PEG9-N 喷洒到皮肤伤口部位后第 3 天或第 12 天记录的 NIR-II 荧光图像。接下来，对小鼠细菌感染的皮肤伤口进行MSOT成像。图 S42–S47（支持信息）显示了在探针 HD-FL-4PEG9-N 原位喷洒在伤口部位后，在给定日期的不同时间点记录的小鼠的横截面 MSOT 图像。在喷洒探头后 30 分钟，模型组的伤口部位出现明显的 MSOT 信号。然而，对于治疗组（用 Tet213 治疗），伤口部位显示很少的 MSOT 信号;在对照组（健康小鼠）中，由于健康小鼠的NO水平较低，伤口部位的MSOT信号可以忽略不计。此外，在探针HD-FL-4PEG9-N喷洒在伤口部位后覆盖伤口部位的3D-MSOT图像如图4C所示。很明显，与治疗组和对照组相比，在小鼠模型组的皮肤伤口部位可以观察到更强的MSOT信号。这些MSOT成像数据与NIR-II荧光成像的结果一致。

结论：

总之，本研究设计了一种被称为“具有外部水化层的同源二元体”的结构设计策略，用于设计具有长吸收和发射波长的花青染料。这种创新设计融合了独特的结构元素：a）在同源二元结构中，两个七次甲基花青通过相对灵活的连接体紧密靠近，这增强了多烯骨架的空间过度拥挤，从而阻碍了反应剂的攻击，从而提高化学稳定性。这种布置还可以防止大范围的𝜋–𝜋堆叠，从而避免吸收蓝移并确保水介质中的光谱稳定性。b)四个亲水性和生物相容性PEG9链战略性地放置在末端杂环上，形成外部水化层。该层不仅具有优异的水溶性和生物相容性，而且还显着减轻了蛋白质结合。这些组合特性可以显着增强光学和化学性能。基于这种方法，开发了一种生物标志物响应的NIR-II探针（HD-FL-4PEG9-N），它具有优异的水溶性、良好的化学稳定性、光稳定性和光学光谱稳定性。该探针响应生物标志物NO，产生明显的NIR-II荧光发射和光声信号。探针HD-FL-4PEG9-N已成功完全用作注射探针来成像急性肾损伤，以及喷雾探针通过响应原位生物标志物NO来成像细菌感染的皮肤伤口。特别是，3DMSOT图像有助于通过3D信息可视化疾病部位/大小。该策略有助于解决大共轭染料长期面临的固有问题，从而释放大共轭染料在生物应用中NIR-II荧光成像和光声成像的潜力。此外，该策略可以为设计用于各种生物应用的其他大共轭生色团提供见解。