摘要:
单细胞组学提供有关单个细胞的未稀释信息,例如转录水平和高度可变蛋白质的序列。 RNase H 依赖性 PCR 启用的 T 细胞受体测序 (rhTCRseq) 允许对 TCR 域异质性进行高效和高度特异性的分析,以表征免疫反应。试验小型化有助于将分析缩小到单细胞水平,而不会降低灵敏度或数据质量。小型化的关键要求是小体积液体处理,而这是人工无法有效完成的,需要自动化。本应用说明介绍了使用 MANTIS® 液体分配器构建质量与从大量 RNA 中构建相媲美的 rhTCRseq cDNA 文库。
介绍:
我们用核糖核酸酶 H 依赖性 PCR 启用的 T 细胞受体测序 (rhTCRseq) 来进行单细胞 TCR 库分析。与从总 RNA 文库制备中重建 TCR 相比,该方法更加精简,提高了获取配对 TCR 亚基(α 和 β)异质性信息的成功率,并确保了整个互补决定区 3 (CDR3) 的恢复。rhTCRseq 使用高度特异性的 PCR 来实现从 TCR mRNA 中靶向扩增 α- 和 β- CDR3 片段。依靠 RNase H 在 PCR 过程中配对时原位生成功能性引物大大提高了该方法的特异性,同时减少了引物二聚体形成和脱靶扩增。工作流程(图 1)开始于我们将单个细胞分类到微孔板中,然后是裂解、cDNA 文库生成、TCR 特异性扩增、对混合样本进行第二次 PCR 以创建测序文库和测序。
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图 1: rhTCRseq 工作流程。
此前,Trombetta 等人开发了一种用于 96 孔格式的单细胞 RNA 测序的协议。通过将 384 孔板中的实验小型化来开发 rhTCRseq 实验方案,将所需样品体积减少了十倍。
试验小型化有几个好处,包括提高灵敏度、减少样品量、提高数据质量和提高通量,同时降低成本和减少废物产生。然而,试验小型化的一个挑战是准确和精确地分配小体积试剂。为了解决这个问题,Dana-Farber 癌症研究所的研究人员使用 MANTIS 液体分配器在 384 孔板中将单细胞 rhTCRseq 试验小型化。
MANTIS 是一种自动化、非接触式、高精度的液体分配器,具有极低的死体积(图 2)。 其独特的基于隔膜的微流体泵被我们称为“芯片”,它可以分配最低 100 nL 的体积,CV 值低于 3%。用户可以通过将充满试剂的移液器吸头直接插入芯片来提供试剂,从而将死体积减少到几微升。 MANTIS 兼容最多 1536 孔的任何板密度,并且能够将任何体积分配到任何孔中。它的芯片可以处理从 1 cP(类似水)到 25 cP(相当于室温下 70% 的甘油溶液)的粘度。 所有这些特性使 MANTIS 非常适合单细胞组学。本应用说明展示了构建高质量 cDNA 文库以对单细胞 T 细胞受体 mRNA 进行高效测序的工作流程。材料和方法:
- 将单个细胞分选到 Twin.tec 384 孔 PCR 板(Eppendorf)中。
- 使用 MANTIS 分液器 (FORMULATRIX),将裂解混合物 (1 μL) 分配到板的每个孔中。
- 将微孔板转移到热循环仪中,并以以下方案运行:50 °C 30 分钟,72 °C 5 分钟和 4 °C(保持)。
- 使用 MANTIS 将 RT 混合物 (1 μL) 分配到板的每个孔中。
- 热循环执行如下:42 °C 90 分钟,70 °C 10 分钟,和 4 °C(保持)。
- 使用 MANTIS,将 PCR 混合物 (8 μL) 分配到板的每个孔中。
- 使用 1 mL 移液器吸头作为储液器,然后使用 MANTIS 将 11 μL ProNex 珠子 (Promega)分配至板的每个孔中。
- 将微孔板置于 MagnaBot 384 磁力分离台 (Promega) 上直至溶液澄清。使用 8 通道移液器移去上清液。
- 使用 MANTIS,在每个孔中分配 30 μL 洗涤缓冲液。
- 洗涤并风干微珠后,使用 MANTIS 将 17 μL 洗脱缓冲液添加到每个孔中。
- 将微孔板置于 MagnaBot 384 上直至溶液澄清,并将 15 μL 上清液从每个孔转移到新板中。
- 使用 2100 生物分析仪 (Agilent) 确定纯化的 cDNA 文库的质量和数量。
结果:
单细胞 cDNA 文库每次运行的平均浓度介于 0.5 和 6.1 ng/μl 之间。单细胞 cDNA 文库的平均片段大小约为 2000 bp,很少或没有小于 400 bp 的物种(图 3,红色轨迹)。 Trombetta 等人针对 96 孔板中的 Smart-Seq2 单细胞 cDNA 文库报告了类似的结果。 这表明在 384 孔板中使用小型化方案不会影响 cDNA 文库中的片段分布。来自 384 个单细胞池的最终 rhTCRseq 文库的生物分析仪轨迹显示 260–400 bp 的片段(图 3,蓝色轨迹)。 在使用散装 RNA 制备的 rhTCRseq 文库中观察到类似的片段大小(图 3,绿色迹线)。这些结果进一步证实,基于单细胞的小型化方案产生的结果可与大量 RNA 方法相媲美。
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图3:生物分析仪轨迹图
总结:
rhTCRseq 的单细胞 RNA-seq 文库制备规模已成功缩小 10 倍。 由此产生的全尺寸 cDNA 文库片段大小分布与先前报告的数据一致。 最终的 rhTCRseq 文库片段分布在由大量 RNA 生成的文库和 384 个单细胞之间是相似的。我们得出结论,RNAseq 反应的小型化不会影响文库的质量或灵敏度。虽然小型化对液体处理提出了严格的要求,但这项工作表明 Mantis 非常适合中等通量 RNAseq 和类似组学应用的小型化。