生成高质量的 cDNA 文库，对来自单细胞的 T 细胞受体 mRNA 进行高效测序

Formulatrix China

2023/03/22 16:33

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摘要：

单细胞组学提供有关单个细胞的未稀释信息，例如转录水平和高度可变蛋白质的序列。 RNase H 依赖性 PCR 启用的 T 细胞受体测序 (rhTCRseq) 允许对 TCR 域异质性进行高效和高度特异性的分析，以表征免疫反应。试验小型化有助于将分析缩小到单细胞水平，而不会降低灵敏度或数据质量。小型化的关键要求是小体积液体处理，而这是人工无法有效完成的，需要自动化。本应用说明介绍了使用 MANTIS® 液体分配器构建质量与从大量 RNA 中构建相媲美的 rhTCRseq cDNA 文库。

介绍：

我们用核糖核酸酶 H 依赖性 PCR 启用的 T 细胞受体测序 (rhTCRseq) 来进行单细胞 TCR 库分析。与从总 RNA 文库制备中重建 TCR 相比，该方法更加精简，提高了获取配对 TCR 亚基（α 和 β）异质性信息的成功率，并确保了整个互补决定区 3 (CDR3) 的恢复。

rhTCRseq 使用高度特异性的 PCR 来实现从 TCR mRNA 中靶向扩增 α- 和 β- CDR3 片段。依靠 RNase H 在 PCR 过程中配对时原位生成功能性引物大大提高了该方法的特异性，同时减少了引物二聚体形成和脱靶扩增。工作流程（图 1）开始于我们将单个细胞分类到微孔板中，然后是裂解、cDNA 文库生成、TCR 特异性扩增、对混合样本进行第二次 PCR 以创建测序文库和测序。

图 1: rhTCRseq 工作流程。

此前，Trombetta 等人开发了一种用于 96 孔格式的单细胞 RNA 测序的协议。通过将 384 孔板中的实验小型化来开发 rhTCRseq 实验方案，将所需样品体积减少了十倍。

试验小型化有几个好处，包括提高灵敏度、减少样品量、提高数据质量和提高通量，同时降低成本和减少废物产生。然而，试验小型化的一个挑战是准确和精确地分配小体积试剂。为了解决这个问题，Dana-Farber 癌症研究所的研究人员使用 MANTIS 液体分配器在 384 孔板中将单细胞 rhTCRseq 试验小型化。

MANTIS 是一种自动化、非接触式、高精度的液体分配器，具有极低的死体积（图 2）。其独特的基于隔膜的微流体泵被我们称为“芯片”，它可以分配最低 100 nL 的体积，CV 值低于 3%。用户可以通过将充满试剂的移液器吸头直接插入芯片来提供试剂，从而将死体积减少到几微升。 MANTIS 兼容最多 1536 孔的任何板密度，并且能够将任何体积分配到任何孔中。它的芯片可以处理从 1 cP（类似水）到 25 cP（相当于室温下 70% 的甘油溶液）的粘度。所有这些特性使 MANTIS 非常适合单细胞组学。

本应用说明展示了构建高质量 cDNA 文库以对单细胞 T 细胞受体 mRNA 进行高效测序的工作流程。

材料和方法：

将单个细胞分选到 Twin.tec 384 孔 PCR 板（Eppendorf）中。
使用 MANTIS 分液器 (FORMULATRIX)，将裂解混合物 (1 μL) 分配到板的每个孔中。
将微孔板转移到热循环仪中，并以以下方案运行：50 °C 30 分钟，72 °C 5 分钟和 4 °C（保持）。
使用 MANTIS 将 RT 混合物 (1 μL) 分配到板的每个孔中。
热循环执行如下：42 °C 90 分钟，70 °C 10 分钟，和 4 °C（保持）。
使用 MANTIS，将 PCR 混合物 (8 μL) 分配到板的每个孔中。
将板转移至热循环仪，并执行以下 PCR 方案：
使用 1 mL 移液器吸头作为储液器，然后使用 MANTIS 将 11 μL ProNex 珠子 (Promega)分配至板的每个孔中。
将微孔板在室温下培养 10 分钟。
将微孔板置于 MagnaBot 384 磁力分离台 (Promega) 上直至溶液澄清。使用 8 通道移液器移去上清液。
使用 MANTIS，在每个孔中分配 30 μL 洗涤缓冲液。
洗涤并风干微珠后，使用 MANTIS 将 17 μL 洗脱缓冲液添加到每个孔中。
将板在室温下培养 5 分钟。
将微孔板置于 MagnaBot 384 上直至溶液澄清，并将 15 μL 上清液从每个孔转移到新板中。
使用 2100 生物分析仪 (Agilent) 确定纯化的 cDNA 文库的质量和数量。

结果：

单细胞 cDNA 文库每次运行的平均浓度介于 0.5 和 6.1 ng/μl 之间。单细胞 cDNA 文库的平均片段大小约为 2000 bp，很少或没有小于 400 bp 的物种（图 3，红色轨迹）。 Trombetta 等人针对 96 孔板中的 Smart-Seq2 单细胞 cDNA 文库报告了类似的结果。这表明在 384 孔板中使用小型化方案不会影响 cDNA 文库中的片段分布。

来自 384 个单细胞池的最终 rhTCRseq 文库的生物分析仪轨迹显示 260–400 bp 的片段（图 3，蓝色轨迹）。在使用散装 RNA 制备的 rhTCRseq 文库中观察到类似的片段大小（图 3，绿色迹线）。这些结果进一步证实，基于单细胞的小型化方案产生的结果可与大量 RNA 方法相媲美。

图3：生物分析仪轨迹图

总结：

rhTCRseq 的单细胞 RNA-seq 文库制备规模已成功缩小 10 倍。由此产生的全尺寸 cDNA 文库片段大小分布与先前报告的数据一致。最终的 rhTCRseq 文库片段分布在由大量 RNA 生成的文库和 384 个单细胞之间是相似的。我们得出结论，RNAseq 反应的小型化不会影响文库的质量或灵敏度。虽然小型化对液体处理提出了严格的要求，但这项工作表明 Mantis 非常适合中等通量 RNAseq 和类似组学应用的小型化。