H9C2细胞培养方法

H9C2细胞描述

大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用

于心肌疾病的研究。大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好 的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。

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H9C2细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头（白色0-10ul；黄色20-200ul；蓝色100-1000ul）、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

试剂：DMEM培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素。

H9C2细胞培养条件

培养基：90%DMEM+10%FBS+P/S

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

传代方法：1:2至1:3，每周 2-3次

冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存

H9c2 （2-1）细胞培养操作

H9c2 (2-1）复苏操作方法

1.将含有1 mL H9c2 （2-1）细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。

2.在1000 rpm条件下离心5 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。

3.然后将所有H9c2（2-1）胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

H9c2（2-1）细胞传代处理

如果H9c2 （2-1）细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗H9c2（2-1）细胞1-2次。

2.加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有H9c2 （2-1）细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

3.将H9c2（2-1）细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

H9c2（2-1）细胞冻存操作

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面 T25 瓶为例

1.收集H9c2（2-1）细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

2.根据H9c2（2-1）细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

H9c2（2-1）细胞培养注意事项

1.H9c2（2-1）细胞溶解过程要迅速，已溶解的冻存细胞不能在常温下存放太久，需要尽快离心去除DMSO。

2.H9c2（2-1）细胞冻存时，尽量吹散细胞，注意控制吹打力度。

H9c2细胞常见问题及解答

为什么H9c2细胞培养会出现细胞表面颗粒较多的现象？

可能是培养环境有问题，可以改用DMEM/F-12培养基培养，传三代后会恢复平整细胞表面。

H9C2细胞可以传几代？

细胞系是可以传代的，理论上是可以无限传代的，也就是永生化细胞，但是研究发现细胞系也会有老化的；收到细胞后自己具体可以传多少代，会受到客户自己养细胞的操作水平技术，操作环境，用的试剂耗材的质量等因素影响的。

为什么H9c2细胞培养会出现空泡？

可能是铺板时铺得不够均匀，局部过于密集，密集地方的细胞就开始状态变差、空泡增多。也可能是血清差，需要更换优质血清，及时换液。

为什么H9c2细胞培养长得慢？

这些因素都会影响细胞长得慢：

1.没有保证密度，细胞长不起来，可以先培养，然后消化重新铺瓶，提高密度培养

2.操作时力度没控制好，将细胞吹碎，状态变差

3.血清质量不好，影响细胞生长

为什么H9c2细胞状态变差，容易漂？

可能是血清问题，建议换血清，并注意血清要程序解冻，不能水浴化开；也有可能是细胞生长密集，需要及时传代，并不是细胞长满才传代，当有个别地方长得过于密集，容易叠加的时候应该就要传代了。

是否可以在 H9C2 细胞系中诱导细胞肥大？

据报道，血管紧张素 II、异丙肾上腺素、内皮素-1、胆固醇（甲基-β-环糊精）、晚期糖基化终产物、去氧肾上腺素、菲、地塞米松、葫芦素-I、溴酸钾、抵抗素、高葡萄糖等可诱导大鼠细胞肥大胎儿心肌细胞 H9c2。

测量 H9C2 细胞大小的最佳染色技术是什么？

可以使用小麦胚芽凝集素 （WGA） 。它可染色细胞膜表面的糖蛋白，并可染色心肌细胞中的 t 小管 （Savio-Galimberti 等人，2008）。

H9C2 细胞培养无小事，在培养过程中，每一步操作都要轻柔小心，以免细胞受损；选用优质培养基，减少有害物质对细胞的刺激。