4%多聚甲醛固定液 （RNA专用）

实验原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

4%多聚甲醛固定液 （RNA专用）实验步骤：

（一）脱蜡和水化：

（二）抗原修复：

（三）免疫组化染色SP法

（四）SABC法

免疫组化问题解答

1、染色过强

 a 抗体浓度过高戒孵育时间过长 。降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时、或4度过夜

 b 孵育温度过高超过37度。 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长戒浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。

2、非特异性背景染色

a 操作过程中冲洗不充分 ：每步冲洗3次每次5分钟。

b 组织中含过氧化物酶未阻断：可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长。

c 组织中含内原性生物素：正常非免疫动物血清再封闭。

d 血清蛋白封闭不充分：延长血清蛋白封闭时间。

3、染色弱

a 抗体浓度过低、孵育时间过短：提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟。

b 试剂超过有效使用时间：应更换试剂。

c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）。

d 室温太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟，或4度冰箱过夜。

e蛋白封闭过度：封闭不要超过12分钟。

4、染色阴性

a 操作步骤错误：应重试、设阳性对照。

b 组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果。

c 一抗不二抗种属连接错误：仔细确定一抗二抗种属无误。

免疫组化技术的关键问题

1.组织处理

2) 组织脱水、透明、浸蜡

2.切片

2)明胶硫酸铬钾法

3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

3.免疫组化染色

2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。

4) PBS冲洗3×3’。

5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。

6) 甩去血清，每张切片加1滴或50ul的抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟戒4℃过夜，建议参阅每种抗体的说明书。

7) PBS冲洗3×5’。

8) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。

9) PBS冲洗3×3’。

10)甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。

11)PBS冲洗3×3’。

12)甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。

13)自来水冲洗，苏木素复染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS冲洗返蓝。

14)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

4%多聚甲醛固定液 （RNA专用）注意事项

免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意：

（1）去除内源酶及内源性生物素

1) 去除内源酶

2) 去除内源性生物素

3）灭活碱性磷酸酶

（2）抑制非特异性背景着色

（3）缓冲液

（4）抗原修复

免疫组化染色

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！