端粒重复片段扩增（TRAP）试剂盒

端粒重复片段扩增（TRAP）试剂盒

TRAP Kit 

产品及特点 端粒酶存在于 85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多

数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是 TRAP (telomeric repeatamplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加不同数量的 TTAGGG 序列这一特点，通过 PCR 检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本产品专门用于快速测定人类细胞端粒酶活性。它具有以下特征：

1. 一站式，提供从细胞裂解到 PCR 的所有试剂，但不含 PAGE 和银染试剂。

2. 一管式操作，端粒酶延伸和 PCR 在同一体系中完成，方便快捷。

3. 提供改进的、长为 150 bp 的内参和含 8 个端粒序列的合成端粒，可有效排除 PCR假阴性。内参长度远大于 TRAP 产物，不会干扰结果分析。

4. 改良的 TS 模板和 PCR 引物，极大降低了引物二聚体的形成。

5. 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。

6. 灵敏度高，最低可以检测到 10 个肿瘤细胞中的端粒酶活性

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 PAGE 电泳及银染试剂盒

使用方法 一：端粒酶的提取

注意：端粒酶的组成成分中有 RNA，极容易被降解，因此，应该跟提取 RNA 一样，尽量在低温条件下快速操作、最好使用固相 RNase 清除剂（CAT#:3090）清洁试验台。
1. 对冷冻的实体组织：将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入 200 uL 预冷的 TRAP 细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴 30 分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次，然后直接进入第 3 步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足 50-100mg，可以按比例降低 TRAP 细胞裂解液的用量。

2. 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷 PBS 洗涤 105-106个经过胰酶处理的细

胞或 50-100 mg 新鲜组织，3000 g 4℃离心 5 分钟，弃上清；加入 200 μL 预冷的 TRAP 细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡 10 秒后置冰浴 30 分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴 30 分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次。如果细胞不足 1×106或 50-100 mg，可按比例降低 TRAP 裂解液的用量。

3. 12000-14000 g 4℃离心 20 分钟。

4. 收集 160 uL 上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定 A215 和 A225得到，计算公式是蛋白质浓度（ug/uL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数，也可使用 BCA 法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后，可用 TRAP 细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样，然后按 10 μL/管（至少可分 15 管），放-80℃冷冻保存（可存放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理 10 分钟）后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的样品对照。如有必要，可以根据起始细胞或实体组织用

量和最终蛋白量计算出每 ug 蛋白所对应的细胞数或实体组织 mg 数。

二：TRAP 反应

5. 确定每个样品的用量：可以按每个反应加入相同的细胞裂解物 ug 数或其所对应的细胞数或实体组织 mg 数来设置 TRAP 反应，为便于分析比较，每个 TRAP 反应所用的蛋白量（或细胞数）必须一样。由于裂解物中一般都有高浓度的不明 TaqDNA 聚合酶抑制物（TRAP 失败最常见的原因），因此最佳结果往往是在稀释10-1000 倍后得到。如果需要稀释，每个样品的稀释度也需要保持一致。

6. 在 PCR 管中按下表设置 TRAP 反应（50 uL 反应体系，以 A 和 B 两个样品为例。

A 阴性对照和 B 阴性对照分别是 A 和 B 样品的热灭活产物）：

成份 A 样品管A 阴性对照管B 样品管B 阴性对照管实验阴性对照实验阳性对照

A 样品 2 uL - - - - -

A 阴性对照 - 2 uL - - - -

B 样品 - - 2 uL - - -

B 阴性对照 - - - 2 uL - -

TRAP

细胞裂解液 - - - - 2 uL -

合成端粒 - - - - - 2 uL

TS 引物

混合物 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL 6 uL

PCR Mix 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL

超纯水 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL 17 uL

注：为避免污染，最好等其他样品加完并盖上 PCR 管盖后再加阳性对照（合成端粒）。

7. 吹打混匀后进行 PCR 扩增，扩增条件（仅供参考，用户可优化）如下：

步骤 温度 时间

端粒酶延伸 30℃ 30 分钟

端粒酶灭活 95℃ 5 分钟

PCR

（循环 35 次）

94℃ 30 秒

55℃ 60 秒

72℃ 30 秒

三：PAGE-银染检测及结果解读（本试剂盒不含 PAGE-银染检测试剂盒）

8. 取 5uL PCR 反应液进行 10%非变性 PAGE 电泳-银染显色实验（需另购试剂盒）。如果背景高（主要是由反应体系中的蛋白成分引起），可以 PCR 产物纯化再进行PAGE 电泳和银染。

9. 跟预期结果（见下表）比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。
成份 样品管结果

样品阴性对照实验阴性对照结果实验阳性对照结果

典型 TRAP 条带（条带数不限）

有则有端粒酶活性无则无端粒酶活性 不出现 不出现 不出现

阳性对照的 TRAP条带（仅 8 条带） 不出现 不出现 不出现 出现

150bp 内参 可出现可不出现 出现 出现 出现

注：本试剂盒所用引物产生的典型 TRAP 条带最小条带为 59bp。当样品端粒活性太强，其端粒产物在扩增时会与 150bp 内参竞争引物，故可能不会出现 150bp 条带。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！