包涵体微量纯化试剂盒

包涵体微量纯化试剂盒

Inclusion Body Miniprep Kit

包涵体是指超表达的蛋白在细胞胞浆内(如果超表达的是胞浆蛋白)或膜间内(如果超表达的是分泌蛋白)凝集形成的无活性的固体颗粒。包涵体形成的主要原因是在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白折叠辅助因子，或环境不适导致无法形成正确的蛋白质次级键。由于包涵体主要由超表达的重组蛋白质组成，因此分离纯化包涵体是分离纯化具有活性的重组蛋白的第一步。本产品就是用于快速的提取高质量的包涵体。

产品特点：
1．操作简单快速，整个过程只要三十分钟左右。
2．微量纯化，可以在1.5mL离心管中完成。
3．能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。
4．A型用于超声法裂菌，B型用于酶法裂菌。
5．可以选择盐酸胍和尿素两种蛋白溶解方式。
6．得到的包涵体溶解液可以用于重折叠、SDS-PAGE或其他纯化处理。

试剂盒组成：

储存条件：常温运输和保存(B型的溶菌酶和Benzonase 需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：

一、超声法裂菌(只适用于A型)
1．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。最好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。
2．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。沉淀(约10mg)放冰上待用或放-80℃保存。
3．加入250μL 冰浴的溶液A，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则不容易沉淀包涵体。
4．直接进入第14步。

二、酶法裂菌(只适用于B型)
5．将600mg 溶菌酶全部加入到5mL溶液A中溶解，然后根据每次的需要量(一次微量提取需要250μl)分成小份放-20℃待用。每次只取用一管。
6．包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶抑制剂混合物(BTN80808)。
7．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。最好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。
8．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。
9．加入250μL含溶菌酶的溶液A重悬细胞。
10．室温放置10-20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。
11．-20℃冷冻至凝固，一定要凝固到细菌溶液变成固体为止。
12．室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA 将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
13．加入1μL Benzonase(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右，否则还需要延长保温时间。
14．12000rpm 4℃离心5分钟，留存上清作为SDS-PAGE 对照样品一。
15．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
16．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品二。
17．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
18．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品三。本产品提供的溶液B足够两次洗涤(两次洗涤一般可得到足够纯净的包涵体)。如果需要更多洗涤，用户需要单独购买包涵体洗涤液(溶液B)
19．沉淀为纯化的包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接用于包涵体溶解。

三、包涵体的溶解：
20.在包涵体沉淀中加入250μL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡室温放置1小时使蛋白质充分溶解。注意：包涵体溶解液含6M 盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样。客户也可以用本试剂盒提供的尿素干粉自配8-10 M 尿素的溶液(尿素溶液不稳定，所以不能长期放置)溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。
21. 20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀(未能溶解的包涵体)。SDS-PAGE 检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
22. 所得蛋白质溶液可以用于复性等试验。用户可本公司购买包涵体复性套装。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！