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动物线粒体总蛋白提取试剂盒
Animal mitochondrial Total Protein Extraction Kit
产品及特点 线粒体是非常重要的细胞器,它不但跟很多人类疾病相关,而且还是母系遗传研究的重要材料。本产品可用于动物细胞线粒体总蛋白的快速微量提取,可用于各种后续实验研究。它具有下列特点:
1. 即开即用,用户不需要自己配制各种溶液,优化各种条件。
2. 本试剂盒有粗提和精提两个操作选项,但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可以直接用于蛋白分析(SDS-PAGE、Western Blot、ELISA 等)、蛋白组分析和线粒体 DNA 纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等实验。
3. 本产品一次可以处理约 2×108个培养细胞,30 mg 培养细胞(相当于 15 瓶 150mm 培养细胞)可以纯化到到 0.5-1.5 mg 线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞,不能用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液,可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
6. 得到的总蛋白可以直接用于 SDS-PAGE、2D 电泳、免疫印迹分析、蛋白活性测定和 BCA 法及 Lowry 法蛋白定量(不适用于 Bradford 法)。
运输及保存 低温运输,130891e、130891f-20℃保存, 其余成分常温保存,保存期限一年。
自备试剂 PBS 缓冲液。
使用方法 注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或冷室进行,所要用到的
溶液和离心管都必须预先冷却,否则线粒体容易破裂。
一:准备工作(此步骤同柱式动物线粒体 DNAout 中线粒体提取步骤)。未用完的下列溶液需要-20℃保存,否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。
1. 将溶液 A 和溶液 B 放冰上预冷待用。
2. 配制 1.7M 高比重溶液(精提时需要配制此溶液,粗提时不需要配制此溶液):36 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 60mL,冰上预冷待用。Dounce 匀浆器
3. 配制 1.0M 低比重溶液。粗提时需要低比重溶液 100mL,配制方法是将 34 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 100mL,冰上预冷待用。精提时需要低比重溶液150mL,配制方法是将 51 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 150mL,冰上预冷待用。
4. 配制线粒体重悬液。粗提时需要重悬液 200mL,配制方法是将 150 mL 溶液 B和 50 mL 1.0M 低比重溶液混合;精提时需要重悬液 300mL,配制方法是将 225mL 溶液 B 和 75 mL 1.0M 低比重溶液混合,即得 300mL 线粒体重悬液,冰上预冷待用。
二:线粒体粗提(此步骤同柱式动物线粒体 DNAout 中线粒体提取步骤)
5. 如果提取材料是单层细胞,先用 60 mL 自备的 PBS 缓冲液洗涤 2×108个培养的单层细胞,共洗涤 2 次。然后用塑料刮匙刮下细胞,重悬在 60 mL PBS 缓冲液中。如果是悬浮细胞,则 1000g 4℃离心 10 分钟收集 2×108 个细胞,再用60 mL PBS 缓冲液洗涤 2 次,最后将细胞重悬在 60 mL PBS 缓冲液中。
6. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机 1000 g 4℃离心 10 分钟,吸弃上清,保留细胞沉淀。
7. 加入 5 倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液 A,轻柔重悬细胞。
8. 冰上放置 4-5 分钟。注意:冰浴时间不要超过 5 分钟。
9. 如果是成纤维细胞,由于其难以裂解,可将细胞重悬液在-80℃放置 20-30 分钟后再化冻,然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞,则直接进入下步操作。
10. 将细胞重悬液体转移到预冷的 Dounce 玻璃匀浆器中(工作体积为 10-15 mL,间隙为 0.12 mm,最好是玻璃材质,否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同,其最适匀浆次数不同,一般需要 40 次-60 次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤,故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数,方法是每匀浆5-10次后,取 2-3 uL 匀浆液到载玻片上,然后在相差显微镜下观察,完整细胞数量降低到 20%以下为佳。
11. 加入 1/3 体积的、预冷的 1.0 M 低比重溶液,轻柔混匀。
12. 用平甩转子离心机 4℃ 1000 g 离心 10 分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核,上清液含线粒体。
13. 转移上清液到离心管中,冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴 50uL 左右上清液到载玻片上,再滴入 50 uL 詹纳斯染液绿 B 染色液 20 分钟,油镜下观察,蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
14. 用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机 4℃ 15000 g 离心 15 分钟,弃上清,所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
15. 用 10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体,4℃ 15000 g 离心 15 分钟,弃上清。
16. 重复上步一次。
17. 最后用适量的线粒体重悬液重悬线粒体,可用于各种后续实验(本试剂盒不提供相关试剂),如果用于下面的精提操作,则用 10mL 线粒体重悬液重悬。
三:线粒体精提(需要超速离心机)
18. 在跟超速离心机匹配的 50 mL 的离心管中,加入 10 mL 预冷的高比重溶液,再在上面加上 10 mL 预冷的低比重溶液,最后再加上 10 mL 线粒体粗提液。
19. 70000g 4℃离心 40 分钟,线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。
20. 小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中,加入等体积的线粒体重悬液。
21. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机 1000 g 4℃离心 10 分钟,吸弃上清,保留线粒体沉淀。
22. 用 10 mL 线粒体重悬液重悬线粒体,在平甩转子离心机上 4℃ 1000 g 离心 10分钟,吸弃上清,保留线粒体沉淀。
23. 再重复上步一次。
24. 最后用适量线粒体重悬液重悬线粒体,得到线粒体精提液。可以直接用于 Lowry法蛋白浓度测定,也可以用于其他后续实验。
四:总蛋白提取
25. 每 10mg 湿重线粒体沉淀加入 0.5 mL 蛋白微量提取溶液 A 和 50 uL 蛋白微量提取溶液 B,吹打混匀。
26. 冰上放置 30 分钟至 1 小时至溶液变清。
27. 4℃ 12,000 g 离心 1 分钟。
28. 将上清液转移至一新的 1.5 mL 塑料离心管中即得到蛋白溶液,可置于-70℃冰箱保存或立即使用。如果要进行 SDS-PAGE 电泳,可取部分样品到离心管中,加入5×SDS-PAGE 上样缓冲液(终浓度为 1×),在沸水中处理 5 分钟后立即上样电泳。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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