可调式易错PCR试剂盒
Controlled Error-prone PCR Kit
易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错PCR和常规PCR的比较如下:
产品特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,实验人员在一定范围内可以控制突变率,一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp,更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3.可用于连续易错PCR,只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4.可以扩增的DNA片段更长,达到3kb,对于3kb以上的产物,建议分段扩增。
试剂盒组成:
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期为一年。
使用方法:
1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。
?注意:引物是决定易错PCR成败的关键因素,设计引物时要保证其Tm在70℃,长度在25-30nt之间,GC含量在45%-60%之间,3端GC含量低,并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2,B表示易错PCR专用的dGTP:
3.以30μL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30μL,各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中,加入下列成分
?注意:可以先计算出超纯水的用量,优先加水
4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件,一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言):
注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增
加1Kb,时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能的突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
5.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板,进行下一轮的易错PCR。
疑难解答:
Q:现象:没有PCR产物。
A:可能原因:一是引物没有优化,可以重新设计引物;二是模板DNA太少,可以增加用量;三是模板不纯,最好先胶回收;四是溶解DNA的溶液中有EDTA,降低了PCR反应体系的Mg离子浓度,可以适当补加Mg离子。
Q:现象:太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A:可能原因:一是PCR循环数太多;二是复性温度太低;三是延伸时间太长;四是引物没有优化,可以重新设计引物;五是PCR条件没优化,可以使用touch-down PCR;六是模板有其他DNA污染;七是DNA模板质量不高或者浓度太高。
Q:如果需要更高的突变率,如何办?
A:可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的第一次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板,否则多样性将受到影响。第三轮易错PCR最好使用所有第二轮的PCR产物作为模板,但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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企业名称
上海泽叶生物科技有限公司
企业信息已认证
企业类型
信用代码
91310116MAJ8N934E
成立日期
2016-08-09
注册资本
100
经营范围
生物科技
上海泽叶生物科技有限公司
公司地址
上海市松江区国家经济开发区北松公路5629号聚科生物松江园区
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