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SP6体外转录试剂盒
SP6 in vitro Transcription Kit
本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒,它利用含有SP6启动子的模版DNA,以NTP为底物,从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA,简单快速获得大量的RNA分子。
产品特点:
1. 即开即用,用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验,不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液,减少加样次数,避免了操作误差,增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA,也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化,每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
?得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。
试剂盒组成:
成分 | 规格 |
转录预配液(2×) | 0.5mL |
阳性对照DNA(1.3 kb片段) | 20μL(10 ng/μL) |
SP6 RNA聚合酶混合液 | 50μl |
RNase-free水 | 1ml |
说明书 | 1份 |
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA,则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物,则可以在设计引物时将SP6启动子序列(5′ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3′)加上,转录其实是从3端G AGN G中的第一个G开始。如果是将DNA片段克隆到载体上,则需要选择有SP6启动子的载体,并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒),则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A,因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染,所以在用作模板前,最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温,然后电泳检测RNA是否被降解,以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中,在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分:
成分 | 加入量 | 备注 |
DNA模板 | xμL | 总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段,建议用50 ng左右;如果模板是质粒DNA,建议用1μg左右;如果用本产品提供的阳性对照,建议用4μL) |
SP6转录预配液(2×) | 10μl | 本成分还含其他促进剂,所以是混合物 |
RNase-free水 | 补水到20μL |
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注:此为20μL反应体系的用量,对其他反应体系,各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针,则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA,则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意:延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活SP6 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。
若需进一步去除DNA模板,可参考下列操作步骤,但所用试剂需另行购买,本试剂盒不提供。
1.在体外转录体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903;3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903;用前需要摇晃混匀),振荡后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇,震荡10秒后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
7. 短暂离心数秒,用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟,所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
疑难解答:
1. 没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染,可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温,再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量,本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor,如果模板RNase污染严重,可能需要用户补加RNase inhibitor。
2. RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G,在前14个碱基内避免有U存在。
3. RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有SP6 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4. RNA长度比预计的长。SP6 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样,有不依赖于模板的加尾功能,最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多,使用的模板又是质粒DNA,则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5. 5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP,则得到的RNA是三磷酸,体外转录时如果保温时间太长(如12小时),则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP,则SP6 RNA聚合酶将优先使用GMP,所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。
6. 如何得到带帽RNA?需加入带帽NTP类似物即可,本公司提供5种供选择。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
SP6体外转录试剂盒信息由上海泽叶生物科技有限公司为您提供,如您想了解更多关于SP6体外转录试剂盒报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。除供应SP6体外转录试剂盒外,上海泽叶生物科技有限公司还可为您提供C8A试剂盒;人补体成分c8α链检测试剂盒(ELISA方法)、RO52试剂盒;人e3泛素蛋白连接酶trim21检测试剂盒(ELISA方法)、IFIH1;人含干扰素诱导解旋酶C域蛋白1检测试剂盒(ELISA方法)等产品,公司有专业的客户服务团队,是您值得信赖的合作伙伴。