大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒（大提无内毒素质粒DNAout）

大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒（大提无内毒素质粒DNAout）

Endo-free Max Column Plasmid DNAout 

产品及特点 本产品是整合经典法大提质粒 DNAout 和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是独家推出的产品，在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉，彻底避免了目前通用的先提取 DNA+内毒素混合物，再从中纯化质粒 DNA 的弊端。用本产品提取的质粒 DNA，内毒素的污染浓度低，适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。

1. 操作简单，只在经典的柱式质粒 DNA 提取前，增加菌体内毒素清除一步。

2. 去内毒素效果好，处理一次可以去除 99%以上的内毒素。

3. 质粒丢失少，产率只比柱式质粒 DNAout 低 5-10%，效果好于先提质粒DNA，再用液相内毒素清除剂处理的方法。

4. DNA 可以直接用于转染等实验。

运输及保存 RNase A 溶液需要低温运输、-20℃保存，其余成分可常温运输、室温或保存，

如有沉淀可加热溶解后再使用。

自备试剂 50 mL 收集管

操作方法 1. 用 50 mL 塑料离心管收集不超过 40 mL 的 E.coli 饱和菌液，5,000 rpm 离

心 5-10 分钟，弃上清，得到细菌沉淀。

2. 加入 10 mL 菌体内毒素清除剂，温和混匀后 5,000 rpm 离心 5-10 分钟，弃上清（含内毒素）。一次洗涤可以去除细菌表面 99%的内毒素。

3. 再重复上述操作 1-3 次，得到的菌体将丢失了绝大部分细胞表面的内毒素。

4. 往细菌沉淀中加入 5 mL 溶液 A（第一次使用时需要将 RNase A 溶液全部加入并混合均匀，未用完的部分放 4℃保存），充分振荡悬浮。注意：充分重悬细胞沉淀（无块状物）对于获得高的质粒产量十分重要。

5. 加 5 mL 溶液 B，（如果溶液 B 在低温放置产生沉淀，须 37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀看到溶液的蓝色变得均匀并且溶液变粘即可（一般需要颠倒 4-6 次），然后冰上放置不超过 5 分钟。注意：冰上放置不要超过 5 分钟，否则质粒 DNA 会有碱损伤。千万不要剧烈振荡，否则基因组 DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒 DNA。溶液 B 用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液 B 中的碱，降低其效率。如

果溶液 B 颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且速跟厂家联系。

6. 加入冰浴的 7 mL 溶液 C，温和反复颠倒直到溶液颜色变成无色（一般需要颠倒混匀 4-6 次）。混匀后可见白色沉淀物产生，然后冰上放置至少 5 分钟让质粒DNA 复性。

7. 6000 rpm 离心 10 分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。

8. 将上步得到的上清液移入到大提离心吸附柱中，放入 50 mL 收集管中。室温

放置 5 分钟左右以便让质粒 DNA 跟膜结合。9. 6000 rpm 离心 5 分钟，质粒 DNA 将与大提离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。

10. 将 10 mL 通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置 2 分钟后 6000 rpm离心 5 分钟，弃穿透液。

11. 重复上步一次。

12. 室温 6000 rpm 空甩 5 分钟，弃穿透液。注意：此步很重要，不能跳过，否则残留乙醇会影响后续实验。

13. 将大提离心吸附柱放入一个干净的 50 mL 塑料离心管中，加 0.5 mL DNA洗脱液 2.0（洗脱液如加热到 50-65℃效果更佳），室温静置 2 分钟后6000rpm 离心 5 分钟，收集液即是质粒 DNA 溶液。

14. 重复上步 3-4 次可洗脱更多的质粒 DNA。DNA 洗脱液 2.0 不够可以用 TE或超纯水替代。

15. 合并所得质粒 DNA，立即使用或-20℃储存。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！