细菌RNA提取c（细菌RNAout）

细菌RNA提取试剂盒（细菌RNAout）

Bacterial RNA extraction kit

本试剂盒是在动物RNA提取试剂盒基础上根据细菌提取的具体情况改良而得。它基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取RNA原理，可用于包括E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides等各种常见的革氏阴性细菌。如果需要提革氏阳性细菌(如Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus等)的RNA，可以选择真菌RNA提取试剂盒。

试剂盒特点：
1. 操作简单快速，只要十分钟左右,可以全在室温下进行。
2. 所得 RNA 质量高,OD260/OD280一般在 1.9，不含基因 DNA污染。
3. 灵敏度高，可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总 RNA。
4. 性价比高于进口同类产品。

试剂盒组成：

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在 1.5mL塑料离心管中离心收集0.2-1.5mL 新鲜细菌(注意:由于细菌RNA 半衰期十分短，所以，必须使用最新鲜细菌)，吸尽液体培养基，加入1mL细菌RNA提取试剂盒并用枪充分吹打，确保细菌全部裂解，没有块状物。
?如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有1mL细菌RNA提取试剂盒的1.5 m塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时，建议使 用助沉剂 RNApp以提高 RNA 回收率。
2. 加入0.2mL 氯仿，在振荡器上充分振荡混均 30秒(必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将DNA 打断和去除蛋白质)。
3. 12000～15000g室温离心3分钟。上清液无色，下层液呈篮色，中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净 1.5ml塑料离心管中，上清液体积约为0.6mL。为避免触及中间层的DNA和蛋白质，建议分小量多次 吸取，并且只取 0.5mL，留 0.1mL左右。当细菌数量较少时，中间层十分松散，上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。
4.在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均 30秒。
5. 12000～15000室温离心 3-10分钟，RNA 将在管底侧面形成沉淀。
6.小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA沉淀。
7.在离心管中加入1mL 75%乙醇，振荡器上振荡混均 30秒。
8. 12000～15000g室温离心 1分钟。
9.小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA沉淀。
10. 重复第 8 到第 10 步一次。
11. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液(约50μl)。
12. 短暂放 1-2分钟后加入适量 RNA 溶解液使 RNA沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。
13. RNA 完整性的电泳检测：
?如果需要做 Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。如果是简单检测，可以使用TAE或的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液(BioTechniques，9：558，1990)。普通 DNA上样液不含变性剂，也没经过去 RNase处理，所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE 所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA 络合复合物迟留在加样孔中(一般会误以为是基因组DNA污染)。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖(如植物中提取的RNA)也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE 对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
?由于细菌细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由23S(约3700nt)，16S(约1700nt)和5S(约100nt)三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合 EB的数量成正比(当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强)，所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA条带的荧光强度强2倍。如果这两条rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA 有降解(因为大的RNA 被酶降解的可能更大)。
14. RNA产量产率测定：
?将5-10μl RNA 溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出 RNA的产量和产率。注意不要将RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260和OD280，否则光吸收比在 TE中测得的低 10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液 pH相关，而 DEPC 水中的DEPC高压分解后产生的CO2与水反应生成碳酸，使溶液 pH降低进而降低 RNA的光吸收。
15. RNA 纯度测定：
?无污染的总 RNA的OD260/OD280一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别DNAScavenger和PS Scavenger去除。

疑难解答：
Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA吗？
A：不是。用 TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳 RNA时容易产生此现象，初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合(如果使用TBE作电泳液的话)形成的复合物，加 RNase处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA变性。使用优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAload可以使 RNA在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2，最好不要使用TBE缓冲液，因为TBE中的硼酸能与RNA的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。
Q：如何确认和去处除污染的基因组 DNA？
A：如果怀疑有 DNA污染，可以用 RNase处理 RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA污染。进一步确认可以使用 PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA 去除剂DNA Scavenger或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的使用说明书进行操作。

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