NT试剂盒;硝基酪氨酸检测试剂盒(ELISA方法)
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗硝基酪氨酸NT抗体包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的硝基酪氨酸NT会与包被抗体结合。依次加入生物素化的抗硝基酪氨酸NT抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗硝基酪氨酸NT抗体与结合在包被抗体上的硝基酪氨酸NT结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB),TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值,NT浓度与OD450值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中NT的浓度。
产品名称:硝基酪氨酸(NT) ELISA 试剂盒
产品编号:ZY-NT-Ge
规格:96T/48T
反应性:硝基酪氨酸
检测范围:6.17-500ng/mL
灵敏度:2.56ng/mL
检测类型:竞争法
形式:预包被96孔板
检测样本类型:细胞上清液,血清,血浆
上样量:100ul
保存: 6个月(2-8℃)
应用:本产品适用于体外定量检测血清、血浆、细胞、组织或其它相关生物液体中NT浓度。
问:同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决?
答:样本保存不当,会导致多次实验结果偏差较大,样本应尽量减少反复冻融,如需多次检测,需在取样后分装保存。
问:检测样本是细胞培养上清,那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗?
答:有影响,所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。
问:请问标曲是每次都要做吗?
答:是的,每次实验,孵育时间,洗板次数等等条件均不一样,不同实验的标曲不能混用,做一次实验需要做一次标准曲线,并且用当次,同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度,才能得到准确的结果。
问:做预实验时每种要做几个复孔呀?
答:预实验视情况而定,如果整个板子孔数较为充足,建议两个复孔,如不充足,单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。
问:血清样本少量溶血,颜色稍深,对结有影响吗?
答:会有影响,建议取样时需注意,避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限,建议用样本稀释液适当稀释,减少基质效应影响。
问:试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗?
答:试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例,但是为大致范围,最好还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。
问:加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大?
答:加完终止液后,显色反应也不是永远停止,形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深,建议在15 min内读数。
问:副孔差别比较大,是没洗干净吗?
答:复孔值差异较大,主要原因应考虑加样是否准确,洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。
问:配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?
答:一般来讲,配好的母液,可以在四度保存,最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的,间隔时间不要太长,一个月之内均可,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。
问:最后显示的OD值在多少之间属于可用值,有要求吗?
答:有的,建议标准曲线最高浓度点的OD值在2.0左右较好,也可参考说明书标曲的数据。
问:样本总是在标准曲线之外,稀释100倍也是,怎么办?
答:在设置稀释倍数之前,需要参考相关文献,对于一些表达极高的蛋白,确实会出现这种情况,建议继续提高稀释比例。
问:试剂盒推荐用450和540nm双波长检测,但条件有限可否换成450和620的双波长?如何使用校准波长?还有,用空白孔校准可以么?
答:可以的,TMB底物显色后,吸光峰值在450nm,另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置,避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值,用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法,因为避免了不同孔的读数影响,防止出现空白孔污染,导致读数较高,无法校准的情况。
问:ELISA可以检测胞内蛋白么?
答:可以的,选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。
问:ELISA试剂盒显色液是双组份的,有些其他品牌的是单组分的,使用单组分的有影响么?
答:HRP酶标二抗的ELISA试剂盒,显色底物一般为TMB,TMB不稳定,曝光或污染氧化后会出现显色反应,导致实验背景升高,或无法使用,所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份,方便稳定保存,仅在使用前混合,避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液,在使用前检测是否为无色透明,如果是正常的,对结果也没有影响,可以放心使用。
问:整个过程需要避光吗?避光需要避到什么程度呢?
答:ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
问:标准曲线在推荐的浓度下,r值为0.9,做了多次都是这样,怎么办?
答:要仔细核对产品说明书,看是否用了推荐的拟合方法,如爱必信的ELISA试剂盒,需要使用四参数拟合方式进行拟合,用错拟合方式,会导致r方值较低;如拟合方式无误,需检查是否有个别标曲孔数值异常,排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。
问:封板膜什么时候用?每次加液后都要换吗?
答:封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是,都要盖好封板膜,减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。
问:手动洗板过程中,拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗?
答:是需要更换的,防止造成交叉污染,影响实验结果的准确性。
问:有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解,怎么办?
答:可提高至55度,并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。
问:测得的值都低于标准曲线的最低值,是什么原因,应该怎么解决?
答:原因较多,首先是检查样品是否稀释倍数过高,降低稀释比,直至直接加样本原液,如还检测不出,需排查原因,建议在实验组别设置中添加阳性对照孔,用明确表达的样品作为阳性对照,如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度,则表明实验成功,其余待测样品表达含量低于检测下限,按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见,在健康样本中,表达含量极低。
问:因为检测限的原因,同一块ELISA板子,部分样本稀释,部分样本1:10稀释,部分1:20稀释,这样设置可行吗?结果可以比较吗?
答:可以比较,不同稀释比例,是因为不同样本间的表达差异较大,只要保证稀释后的检测样品测量值准确,还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。
问:试剂盒里面有捕获抗体么?
答:即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。
问:ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?
答:根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限最好不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。
问:In vivo周期长的话,不太好做预实验,怎么办?
答:In vivo造模取样后,可将样品分装,取一部分样品做ELISA预实验,剩余样品再进行正式实验;如多批次实验,操作较为一致,后续可取消预实验,根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。
问:做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?
答:需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。
问:ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机,需要如何操作?
答:实验室ELISA实验做的较多,还是建议使用洗板机洗板,效果更好,也更方便控制。如果没有洗板机,在洗板过程中,需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出,在加洗板液后,静置1-2min,甩干液体后,在吸水纸上大力拍干;重复三次。
问:ELISA实验中,酶标抗体识别的是哪个抗体?
答:在双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。
问:捕获抗体如何包被在96孔板上?
答:如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被;如果是非即用型的ELISA试剂盒,首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作浓度,然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体,室温或4℃过夜包被,然后进行洗板和封闭之后即可使用,如需长期保存,需要真空冻干后保存
问:ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?
答:不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。
问: ELISA可以测DNA的表观么?
答:不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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