检测奶及奶制品中黄曲霉素M1的三种方法

二、参考标准：根据国标《GB 5413.37—2010》食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定。

（一）免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合GB 5413.37-2010国标方法

1. 所需设备和耗材　　

高效液相色谱仪

色谱柱：真菌毒素专用色谱柱（PRC-18，Pribolab）。

免疫亲和柱：PriboFast®黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3, Pribolab，25支/盒，快速过柱型，适用于粘稠样本：如生鲜乳、酸奶等,有效解决过柱易堵问题)。

高速均质器：不锈钢耐腐蚀,转速达到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纤维滤纸：PriboFast®玻璃纤维滤纸（GMF/A-110，Pribolab）

PriboFast®八位泵流操作架（Pribolab，用于控制免疫亲和柱过柱流速）

标准品：Aflatoxin M1（固体标准品MSS1007  100ug或0.5µg/ml Aflatoxin M1 液体标准品，Pribolab)

2. 样品前处理:普瑞邦针对生鲜乳、干酪、奶油等提供不同的处理方案(详细方案请联系Pribolab中国:400-688-5349，普瑞邦开发了针对多种奶品基质提供优化的前处理方案)

3. 免疫亲和柱净化: PriboFast®黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3, Pribolab)

富集:提取液以2-3mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体；

洗涤: 10mL 0.1%的吐温/PBS清洗，以10mL水洗柱子2次，并使2-3mL空气通过柱体。

洗脱：加入1.0mL色谱级甲醇洗脱,孵育30秒以上,以流速为1-2mL/min过柱，收集全部洗脱液供检测用。

4. 高效液相色谱分析 

色谱柱：C18，长25 cm，内径4.6 mm；

流动相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)；

流速：1 mL/min。

（二）酶联免疫法

1. 方法原理

采用直接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素M1抗原，加入样本（或黄曲霉毒素M1标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合酶标抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素M1量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素M1的含量。

2. 试剂和材料：酶联免疫试剂盒（PriboFastR黄曲霉毒素M1 试剂盒 EKT-012，Pribolab）

3. 样本前处理：牛奶：离心取下层待测。奶粉：复溶离心取下层待测。

4. 检测步骤

4.1 免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酶标仪读OD值。

5. 分析结果的表述

用酶标仪判读结果。

（三）免疫金标快速检测法

1. 方法原理

黄曲霉毒素M1(AFM1)快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的黄曲霉毒素M1在酶标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上AFM1－BSA偶联物的结合。如果样本中黄曲霉素M1含量大于0.5 ug/L，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。

2. 试剂和材料

胶体金检测试纸：PriboStripTM黄曲霉毒素M1免疫金标快速检测条（PR-012，Pribolab）

3. 分析步骤：奶粉复溶后检测；液态奶直接检测。吸取奶液滴加到加样孔中，8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下：T 线显色比C线深或一样深是阴性。T 线显色比C线浅，或无显色是阳性结果。

孙庆磊 17615852702