食品中蛋白质含量的测定（凯氏定氮法）

三、仪器和设备：

3.1 天平：感量为 1mg。

3.2 万用电炉。
3.3 定氮蒸馏装置：如图 1 所示。
3.4 自动凯氏定氮仪。

四、试剂和材料

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。

4.1 硫酸铜（ CuSO4·5H2O）。
4.2 硫酸钾（ K2SO4）。
4.3 硫酸（ H2SO4 密度为 1.84g/L）。
4.4 硼酸（ H3BO3）。
4.5 甲基红指示剂（ C15H15N3O2）。
4.6 溴甲酚绿指示剂（ C21H14Br4O5S）。
4.7 亚甲基蓝指示剂（ C16H18ClN3S·3H2O）。
4.8 氢氧化钠（ NaOH）。
4.9 95%乙醇（ C2H5OH）。
4.10 硼酸溶液（ 20 g/L）：称取 20 g 硼酸，加水溶解后并稀释至 1000 mL。

4.11 氢氧化钠溶液（ 400 g/L）：称取 40 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至 100 mL。
4.12 硫酸标准滴定溶液（ 0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定溶液（ 0.0500 mol/L）。
4.13 甲基红乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 甲基红，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。
4.14 亚甲基蓝乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 亚甲基蓝，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。
4.15 溴甲酚绿乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 溴甲酚绿，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。
4.16 混合指示液： 2 份甲基红乙醇溶液（ 4.13）与 1 份亚甲基蓝乙醇溶液（ 4.14）临用时混合。也可用1 份甲基红乙醇溶液（ 4.13）与 5 份溴甲酚绿乙醇溶液（ 4.15）临用时混合。

五、 分析步骤

5.1 凯氏定氮法

5.1.1 试样处理：称取充分混匀的固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样 10 g～25 g（约相当于 30 mg～40 mg 氮），精确至 0.001 g，移入干燥的 100 mL、 250 mL 或 500 mL 定氮瓶中，加入 0.2 g 硫酸铜（ 4.1）、 6 g 硫酸钾（ 4.2）及 20 mL 硫酸（ 4.3），轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热 0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入 20 mL 水。放冷后，移入 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
5.1.2 测定：按图 1 装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至 2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（ 4.13）数滴及数毫升硫酸（ 4.3），以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
5.1.3 向接收瓶内加入 10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及 1 滴～2 滴混合指示液（ 4.16），并使冷凝管的下端插入液面下， 根据试样中氮含量， 准确吸取 2.0 mL～10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室， 以 10 mL洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将 10.0 mL 氢氧化钠溶液(4.11)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏 10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏 1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液(4.12)滴定至终点，其中 2 份甲基红乙醇溶液(4.13)与 1 份亚甲基蓝乙醇溶液(4.14)指示剂，颜色由紫红色变成灰色， pH 5.4； 1 份甲基红乙醇溶液(4.13)与  5 份溴甲酚绿乙醇溶液(4.15)指示剂，颜色由酒红色变成绿色， pH 5.1。同时作试剂空白。

5.2 自动凯氏定氮仪法

称取固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样 10 g～25 g （约相当于 30 mg～40 mg 氮），精确至 0.001 g。按照仪器说明书的要求进行检测。

六、 分析结果的表述

试样中蛋白质的含量按式（ 1）进行计算。

式中：
X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（ g/100 g）；
V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（ mL）；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（ mL）；
V3——吸取消化液的体积，单位为毫升（ mL）；
c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（ mol/L）；
0.0140——1.0 mL 硫酸[c (1/2H2SO4)＝1.000 mol/L]或盐酸[c (HCl) ＝1.000 mol/L]标准滴定溶液
相当的氮的质量，单位为克（ g）；
m——试样的质量，单位为克（ g）；
F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；纯乳与纯乳制品为 6.38；面粉为 5.70；玉米、高粱为 6.24；花生为 5.46；大米为 5.95；大豆及其粗加工制品为 5.71；大豆蛋白制品为 6.25；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.30；复合配方食品为 6.25。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。

七、 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。

联系人：孙庆磊 17615852702