Big Panel Theory系列之——量化人体免疫细胞的“老龄化”

人体的免疫系统功能随着年龄增长而逐渐衰退，老年人对病原体感染表现得更为敏感，对预防性疫苗的反应更为微弱。这个过程伴随着干祖细胞、固有免疫和获得性免疫细胞的丰度与功能性改变，即所谓的“免疫衰老”（Immunosenescence）。针对免疫衰老这一新兴课题的研究，一方面要求对于大规模样本进行长期跟踪随访，另一方面经常需要统计大量数据进而聚焦到稀有免疫细胞亚群的变化，几乎等同于大海捞针的难度。高维流式平台结合单细胞转录组测序的策略，以其高通量、高精度、高效率等优势被广泛应用于这一领域的研究中。

图1 - 人体免疫衰老及其相关过程1

来自圣路易斯华盛顿大学的团队发表在Immunity杂志的成果，耗费3年时间募集了25-85岁的166位健康供者的317份外周血样本，按照年龄段分为A-E共5组。采用单细胞转录组测序技术，从55个PBMC细胞群中筛选出12群与衰老相关的细胞亚群。结合全光谱流式平台，全景式描绘出人体健康衰老过程中的免疫系统变化。接下来主要对文章中全光谱流式相关的结果进行解读。

图2 - 研究流程示意图2

全光谱流式方案囊括30种荧光素，免疫指标根据单细胞转录组测序结果进行筛选。研究人员将冻存的PBMC复苏后，用LIVE/DEAD Blue活性染料染色，4℃环境下进行抗体孵育，采用顺序染色的步骤，预染γδTCR和CD25抗体5 min，接着加入CCR5、CxCR3和CCR4染色10 min，再加入NKp80和KLRG1染5 min，最后再补入剩余的抗体混合液。样本采用5激光Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪 进行数据采集。

图3 - 全光谱流式免疫衰老检测方案

图4 - 全光谱流式T细胞深度圈门策略

研究人员分别选取年轻组（28-35岁）和老龄组（68-80岁）各13名，围绕单细胞转录组测序发现的衰老相关细胞亚群进行表型验证，全光谱流式结果观测到naïve CD4+ T细胞并未随衰老发生丰度变化（图5C），这与单细胞转录组测序结果一致。进一步的门控结果表明， HLA-DR+和Th2 CD4+ T细胞比例在老龄组显著性升高（p.adj < 0.05），可以作为外周循环系统中CD4+ T细胞“老龄化”的关键性标志（图5M, O）。

对于CD8+ T细胞，NKG2C+GZMB-NKp80-（NKG2C即KLRC2）细胞亚群在老龄组中显著性降低，反之，CCR4+ CD8+ Tcm显著性升高。与CD4+/CD8+类似，CCR4+ /CCR4-的比例随着年龄增长呈现升高趋势，上述指标可以作为CD8+ T细胞“老龄化”的关键性标志（图5D, F, G）。

图5 - 免疫衰老的T细胞丰度变化

根据单细胞转录组测序结合全光谱流式分析的双平台数据呈现，首次发现NKG2C+GZMB-CD8+记忆T细胞丰度下降与衰老相关。在CD4+记忆T细胞中也观察到衰老相关的亚群变化，包括Th2和HLA-DR+ CD4+ T细胞，而naïve Treg细胞则显著性降低。HLA-DR+ CD4+ Tmem细胞与衰老相关也是第一次被发现并报道。II型CD4+和CD8+记忆T细胞的增加，分泌产生更多的IL-4，阐明了健康衰老过程中免疫稳态的重塑与CD4、CD8亚群的II型免疫标志物增加存在相关性。

图6 - 人体健康衰老的免疫系统变化示意图

研究人员筛选了25-85岁年龄组的健康人群的外周血样本，开展了广泛、大规模的单细胞分析，构建了人类健康衰老的系统性理论框架。单细胞测序技术探索发现，全光谱流式系统佐证扩展，双平台强强联合，优势互补，运用多组学数据的分析思维在人类衰老的新兴课题中碰撞出新的火花。

在之前的推文中，我们分享了使用Cytek^® Aurora™全光谱流式细胞仪建立了T细胞17色方案与B & Innate细胞18色方案，绘制了0-75岁共96位健康志愿者免疫系统发育全景图谱。欢迎点击阅读：从出生到衰老，免疫系统发生了哪些变化？

参考文献

1Müller, L., Di Benedetto, S. & Pawelec, G. in Encyclopedia of Gerontology and Population Aging   (eds Danan Gu & Matthew E. Dupre)  1-12 (Springer International Publishing, 2019).

2Terekhova, M. et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of NKG2C(+)GZMB(-)CD8(+) memory T cells and accumulation of type 2 memory T cells. Immunity, doi:10.1016/j.immuni.2023.10.013 (2023).