详解酶底物法检测水中粪大肠菌群检测实验步骤

酶底物法检测大肠菌群是近年来新兴的一种方法，其相较于传统的多管发酵法、滤膜法等操作更加简单、检测快捷有效。目前该方法也是全球都在广泛使用的方法，在2018年该方法也被纳入国标。今天，我们就和大家一起来说说酶底物法检测大肠菌群的具体步骤，希望对大家有所帮助。

一、酶底物法检测大肠菌群操作方法

1、工作原理

酶底物法检测大肠菌群是在特定温度下培养特定的时间，粪大肠菌群能产生酶底物法采用大肠菌群能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)的细菌群组，其能分解色原底物释放出色原体，使培养基呈颜色变化，以此来检测水中的大肠菌群。

2、实验室用水

实验室用水为无菌水，取来适量的纯净水，放在烧杯中，经过121摄氏度，高压蒸汽灭菌，需要20分钟。

3、采样瓶的清洗准备

(1) 是新购买的500ml具旋帽或者是磨口塞得广口玻璃瓶, 应在百分之二的盐酸中浸泡几个小时, 还需要用自来水冲洗干净, 再用纯净水清洗1-2次, 控干, 备用。

(2) 将清洗干净干燥的采样器, 用专用的纸包裹起来, 放入恒温干燥箱内, 将温度设置到121摄氏度, 灭菌20分钟, 烘干。灭菌完成后, 还需要关闭实验室电源待温度降到50摄氏度以下时, 方可开门取样品瓶, 不然, 玻璃瓶会因为操作不当爆裂。

4、仪器和试剂

仪器：培养箱(36±1℃)、高压蒸汽灭菌器、定量盘(51孔和97孔)、程控定量封口机、试管、稀释瓶、移液管、量筒。

酶底物法检测仪器及其配置

试剂：立科Colitech酶底物法检测试剂，灭菌稀释水。

5、酶底物法检测操作步骤

1)水样稀释

检测实验所需水样为100ml，若水样污染严重可进行稀释(取10ml水样加入到90ml的灭菌稀释水中，必要时可加大稀释度)。本实验取20个水样分别进行总大肠菌群(1-10号)和粪大肠菌群(11-20号)的检测。

大肠菌群水样取样瓶

2)定性试验

　　用100ml的无菌稀释瓶量取100ml水样，加入专用培养基，摇晃至溶解，以36±1℃的温度在培养箱培养24小时。

3)定量试验

　用100ml的无菌稀释瓶量取100ml水样，加入专用培养基，摇晃至溶解，将该溶液导入51孔(总大肠菌群)和97孔(粪大肠菌群)的定量盘内，然后将定量盘放入立科程控定量封口机封口，以36±1℃的温度在培养箱培养24小时。

2、结果判定

检测结果对比

1)定性反应

　对水样培养24小时后进行结果判定，如颜色变成黄色，则判定为阳性，表示水中含有大肠菌群，若水样未发生颜色变化，则判定为阴性，表示水样中不含大肠菌群。定性结果以大肠菌群检出或未检出作报告。

2)定量反应

对培养24小时后定量盘内的水样进行结果判定，若孔穴内的水样有黄色反应则表示该孔穴中含有大肠菌群，总大肠菌群对照51孔定量盘MPN表，粪大肠菌群对照97孔定量盘MPN表，结果以MPN/L报告。若所有孔穴均未产生黄色反应，以未检出作报告。