Cas9稳定表达的人乳腺癌细胞；MCF7-Cas9-543规格

细胞名称 Cas9稳定表达的人乳腺癌细胞；MCF7-Cas9-543

形态特性  上皮样

生长特性 贴壁生长　

特征特性  该细胞是采用慢病毒感染的方式使MCF7细胞稳定表达Cas9-Flag-Neo，经400ug/mlG418筛选得到的单克隆，经Western Blotting验证该克隆可以表达Cas9蛋白，可直接用Crispr技术编辑基因组DNA。

培养条件  DMEM-H: Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DME H-21 4.5g/Liter Glucose)  10%FBS；400ug/ml G418　

传代方法  1:3~1:6传代；每周2~3次。　

传代情况 C3

冻存条件  基础培养基+5%DMSO+20%FBS　　

细胞培养操作规程：

主要功能：

（1）血管平滑肌细胞的再生能力是原发血管病变的重要因素。

（2）表达钙通道及ICAM-1和VCAM-1，参与血管壁的炎症反应。

（3）与血管疾病的进展和稳定有关。

生理变化：

（1）主动脉硬化。

（2）主动脉瘤

（3）主动脉钙化。

一般培养方法:

1、组织块培养法

A）按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

B）Cas9稳定表达的人乳腺癌细胞；MCF7-Cas9-543规格将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm～12.5px，一般在25mL培养瓶（底面积为437.5px2）可接种20～30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

C）培养2～4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块 不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻 拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3～5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

2、消化培养法

该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

3、悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

培养操作：

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。      

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消化。  

3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取

phospho-Caseine Kinase 1 alpha (Thr1194) 英文名称： 磷酸化酪蛋白激酶casein kinase Iα抗体 0.1ml

Anti-HPV16-E7 人类状瘤病毒16-E7抗体Multi-class antibodies规格： 0.2ml

TSTA(Human tumor specific transplantation antigen) ELISA Kit 人特异性移植抗原Multi-class antibodies规格： 48T

Anti-HER2/c-erbB2 HER2受体抗体Multi-class antibodies规格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh MIDN 中脑核仁蛋白抗体 规格 0.2ml

PLAP(Human Placental alkaline pkosphatase) ELISA Kit 人胎盘碱性磷酸酶 96T

RNF34 英文名称： 环指蛋白34抗体 0.2ml
Cas9稳定表达的人乳腺癌细胞；MCF7-Cas9-543规格DRD4 英文名称： 多巴胺受体D4抗体 0.1ml

Anti-ABCA1 腺苷三磷酸结合盒转运体A1抗体Multi-class antibodies规格： 0.1ml

DLK1 英文名称： 穿膜蛋白DLK1抗体(C端) 0.1ml

锚定蛋白G抗体 Anti-Ankyrin G/ANK-3/ankyrin 3 0.1ml

Anti-ZNF268(1a)/FITC 荧光素标记锌指脂蛋白-1a抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh Phospho-Estrogen Receptor alpha (Ser305) 磷酸化雌激素受体α抗体 规格 0.1ml

Cyr61/IGFBP10/CCN1(cysteine rich 61) 富半胱氨酸肝素结合蛋白61抗原Multi-class antibodies规格： 0.5mg
Cas9稳定表达的人乳腺癌细胞；MCF7-Cas9-543规格运输保存：采用干冰保存运输。收到细胞时，若干冰已经完全融化，请立即将细胞复苏培养；若尚留有干冰，请立即将细胞放入液氮中保存待用，请按指定条件贮存细胞，切不可将细胞置于高温环境。