新手必看，超详细的Waters2695液相色谱仪操作规程

一、开机前的准备工作：

1．检查设备电源、流路、信号连接是否完好；

2．流动相：配制相应的流动相，经0.22mm微孔滤膜抽真空过滤后，或检查是否需要添加。适当选择滤膜，水系/有机系（反光面朝上）。

3．样品溶液：按方法取样或配制标准样品溶液，0.22mm滤膜过滤。

二、开机平衡系统：

1．开机自检：打开电源开关，仪器开始自检（4-5min），待屏幕上方出现“Idle”自检完成。

2．脱气：按面板右下方“Menu/Status”键进入“Status”界面，移动光标至“Degasser Mode”，按Enter选择“On”，打开在线脱气。一般默认是开的。

3．设定柱温：在“Status”界面，光标至“Col Htr Set”，输入目标温按Enter。

4．清洗柱塞杆：按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Diag”，然后再按下排功能键“Prime Seal Wsh”，“Start”，冲洗1~2min后，“HALT”，“CLOSE”。

5．Wet Prime：在“Status”界面中“Composition”下，选择将用到的溶剂通道为“100%”，按液晶屏幕右下角“Direct Function”键，移动光标选择“Wet Prime”，“OK”，流速及时间可使用默认值，也可自行设定（如：5ml/min，3min），“OK”即可。

将每一个会用到的溶剂通道按照上述操作一次。（也可各通道选25%v 5ml/min，3min）。

6．注射器排气泡及清洗：进入“Direct Function”界面后，选择“Purge Injector”，“OK”，默认数值为6，“OK”。

7．清洗注射针：进入“Diagnostics”界面，按下排功能键之“Prime Ndl Wsh”，“Start”，默认30秒钟，“Close”，即可返回“Diagnostics”界面。

注：以上4-7为溶剂系统前处理过程，建议每天开机后依次进行。若发现注射器中有气泡，则可重复6）直至排除。

8．平衡柱子：在“Status”界面上，按流动相比例设定各通道溶剂比例后，再Wet Prime操作一次，然后设置流速，平衡色谱柱30-60min。

三、编辑仪器方法和方法组:

1．打开电脑双击桌面上的Empower，输入用户名system、密码manager选择项目和系统。

2．新建方法与方法组

新建方法：单击监视区方法组编辑向导—新建—2695的参数：单次输送体积（建议130）、针头深度0、脱气设置开、泵模式（等度/梯度）、柱温。2489配置：通用（灯开启、波长）—文件—另存为（输入方法名XX）-保存-退出。

新建方法组：选择所需的方法名称，点击下一步—输入方法组名（与方法名一致）。

四、进样：

1．待“监视基线”稳定后，点击“中断样品组”开关，进入“进样”阶段。

2．当进行单进样时，在“运行样品”的“单进样”界面中输入“样品名”“功能”“方法组”“进样体积”“运行时间”等；“单进样”就是单次进样，完成分析后即停止检测（流动相正常走动）；

3．当多进样时，在“运行样品”的“样品”界面点击“样品瓶”输入所有样品分别所在位置（输入所在编号），“进样体积”、“进样数”、“功能”、“方法组”、“运行时间”等。

4．开启绿色“运行”－“运行样品”开关。

五、关机：

1．清洗注射器、针、柱塞杆：方法同开机平衡系统中的4-7。

如果流动相中含有盐类，则实验结束后必须用水清洗柱塞杆。

2．如果流动相使用了盐，注意不要让有机溶剂直接和缓冲盐接触，中间要使用水过渡一下。先用水/甲醇（或乙腈）=95/5在1ml/min流速下清洗色谱柱和系统30分钟，再用甲醇或乙腈清洗30分钟；如果流动相中没有使用盐，则用甲醇或乙腈清洗色谱柱和系统30分钟。

3．降低流速至0，待系统压力回零后，退出Empower软件系统，关闭HPLC系统。最后，关闭计算机及显示器电源。

六、仪器使用注意事项:

1．水性流动相使用不要超过二天，最好每天新鲜配制以免微生物的生长。

2．样品组方法里的“功能”一项，有“平衡”及“平衡色谱柱”两个选项，其功能不同。若仪器方法选用梯度，用“平衡色谱柱”可以在进样前运行梯度来平衡柱子；而如果选用“平衡”则只是按照初始梯度条件等度平衡柱子。（当然，如果用等度的流动相条件，则两者没有区别）。

3．清洗柱塞杆的溶剂可以用水，或5%-10%甲醇（抑菌）。

4．清洗针的溶剂可以根据样品溶解性选择，如甲醇，或异丙醇-水（1：1）。

5．“实验结束后要注射器排气泡及清洗（purge injector）”，1次即可，包括了“purge sample loop”。

6．在线脱气机打开后，开始时运行加速，压力很快降到1.0psi以下，然后维持0.5psi左右。

7．怀疑管路堵塞可卸下单向阀和在线过滤器进行清洗。单向阀安装注意方向（箭头朝上）。

8．注射器中的气泡快速有效排除方法：可以小心的卸下注射器抽吸甲醇排除气泡后，注射器中保留少量溶剂，做“purge injector”小心安装上，再做几次“purge injector”观察没有气泡即可。其他方法，可以在“purge injector”开始后、注射器杆向上时，拧掉下边螺丝，上下抽推排除气泡，但手动排泡过程要在purge injector结束前完成。溶剂用甲醇较好,不用同时拧掉上方注射器。

9．当有多个“仪器方法”和“方法组”存在时要注意选择当前需要使用的“仪器方法”和“方法组”；当“仪器方法”改变时尤其是流动相组成等发生变化时，必须对系统重建平衡，也就是在新的“仪器方法”流动相条件下平衡系统30分钟以上，使得基线重新稳定。

10．长期不使用HPLC，应该将色谱柱从系统拆除，拆除前应该充分平衡色谱柱，一般为用甲醇或乙腈冲洗色谱柱40分钟以上。

11．若色谱柱长期保存未使用，则刚装入HPLC系统时应以流量0.2mL/min平衡过夜（注意断开检测器避免不必要的检测器耗损），然后再以0.8mL/min流量平衡30分钟以上。以低流量缓慢的提高流速直到获得稳定的基线，这样可以保证色谱柱的使用寿命。当然在分析结束时冲洗色谱柱及系统后停止流量时也应该从高流量逐步过渡到低流量直到流量为0。

12．系统短期不使用，应该在每次使用后冲洗系统30分钟以上。