pGAPZαC毕赤酵母质粒
基本信息
启动子: GAP
复制子: pUC ori
终止子: AOX1 TT
质粒大小: 3251bp
质粒标签: C-Myc, C-6×His
原核抗性: Zeo
筛选标记: 博来霉素Zeo
克隆菌株: DH5α
培养条件: 37℃,有氧 LB
表达宿主: 酵母细胞
培养条件: 28℃,YPD
5'测序引物: pGAP-F:GTCCCTATTTCAATCAATTGAA
3'测序引物: AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT
质粒简介
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的酶在许多生物细胞中包括毕赤酵母,稳定高水平表达。最近GAPDH蛋白编码基因启动子(GAP)被深入研究,并在毕赤酵母中能够高水表达重组蛋白,这取决于使用的碳源(Waterham等 人,,1997)。GAP启动子(PGAP)的重组蛋白表达水平略高于AOX1启动子。
pGAPZ A,B,和C载体(2.9 KB)和pGAPZαB和C(3.1 KB)载体使用GAP启动子在毕赤酵母中稳定表达重组蛋白。重组蛋白表达为为带有C-末端myc抗原表位和C端His标签的融合蛋白。此外,pGAPZα 表达的融合蛋白在N-端带有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子分泌信号肽。这两个系列的载体都提供三个不同读码框的载体,以方便克隆的带有C-端标签和/或N-末端分泌信号肽的载体中。
质粒图谱
pGAPZαC毕赤酵母质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
pGAPZαC毕赤酵母质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。
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