pGAPZαB毕赤酵母质粒

pGAPZαB毕赤酵母质粒

基本信息

启动子: GAP

复制子: pUC ori

终止子: AOX1 TT

质粒分类: 酵母系列，毕赤酵母表达载体

质粒大小: 3151bp

质粒标签: C-Myc, C-6×His

原核抗性: Zeo

筛选标记: 博来霉素Zeo

克隆菌株: DH5α

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 酵母细胞

培养条件: 28℃，YPD

5'测序引物: pGAP-F:GTCCCTATTTCAATCAATTGAA

3'测序引物: AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT

质粒简介

    甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的酶在许多生物细胞中包括毕赤酵母，稳定高水平表达。最近GAPDH蛋白编码基因启动子（GAP）被深入研究，并在毕赤酵母中能够高水表达重组蛋白，这取决于使用的碳源（Waterham等 人，，1997）。GAP启动子（PGAP）的重组蛋白表达水平略高于AOX1启动子。

     pGAPZ A，B，和C载体（2.9 KB）和pGAPZαB和C（3.1 KB）载体使用GAP启动子在毕赤酵母中稳定表达重组蛋白。重组蛋白表达为为带有C-末端myc抗原表位和C端His标签的融合蛋白。此外，pGAPZα 表达的融合蛋白在N-端带有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的α-因子分泌信号肽。这两个系列的载体都提供三个不同读码框的载体，以方便克隆的带有C-端标签和/或N-末端分泌信号肽的载体中。

质粒图谱

pGAPZαB毕赤酵母质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pGAPZαB毕赤酵母质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。