pPIC9毕赤酵母质粒

pPIC9毕赤酵母质粒

基本信息

启动子: AOX1

复制子: pBR322 ori

质粒分类: 酵母系列，毕赤酵母表达载体

质粒大小: 8023bp

原核抗性: Amp

筛选标记: HIS4

克隆菌株: DH5α

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 酵母细胞

5'测序引物: AOX5:GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3'测序引物: AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT

质粒简介

    pPIC9是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。1.pPIC9载体大小8,023 bp，是融合表达载体。2.载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为Xho I, SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I. 3.利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。4.在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。5.毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。6.为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 7..为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者Stu I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+ Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型) 8.将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用Bgl II线性化质粒 (产生His+MutS基因型)。

质粒图谱

pPIC9毕赤酵母质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pPIC9毕赤酵母质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。