pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒

pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒

基本信息

复制子: pUC ori,f1 ori

终止子: SV40 poly(A) signal

质粒分类: 哺乳系列质粒；哺乳荧光质粒；哺乳绿色质粒

质粒大小: 4150bp

质粒标签: C-AcGFP1

原核抗性: 卡那霉素Kan（50μg/ml）

筛选标记: 新霉素Neo/G418

克隆菌株: DH5α等大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧 LB

表达宿主: 293T等哺乳细胞

诱导方式: 无须诱导，瞬时表达

5'测序引物: AcGFP-1-F (GCGTCGATTTTTGTGATGCTC)

3'测序引物: Sv40-polyA-R（GAAATTTGTGATGCTATTGC）

备注: 哺乳细胞启动子检测载体

质粒简介

        pAcGFP1-1质粒是 AcGFP的衍生物，来自Aequorea coerulescens。 AcGFP1已经优化了更亮的荧光。（激发最大值= 475nm;发射最大值= 505nm）AcGFP1基因的编码序列含有沉默碱基变化，其对应于人类密码子使用偏好。

        pAcGFP1-1是一种无启动子载体，可用于监测插入到多克隆位点（MCS）中的不同启动子和启动子/增强子组合的转录。AcGFP1上游的序列已经转化为Kozak共有翻译起始位点（2），以增强真核细胞中的翻译效率。AcGFP1基因下游的SV40多聚腺苷酸信号直接适当处理AcGFP1 mRNA的3'末端。载体主链含有用于在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中复制的SV40来源，用于在大肠杆菌中繁殖的pUC起始点和用于单链DNA生产的f1起点。新霉素抗性盒（Neor）允许使用G418选择稳定转染的真核细胞。该盒由SV40早期启动子,Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和来自单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV TK）基因的多聚腺苷酸化信号组成。盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性。

       pAcGFP1-1 encodes the green fuorescent protein AcGFP1, a derivative of AcGFP from Aequorea coerulescens. AcGFP1 has been optimized for brighter fuorescence. (Excitation maximum = 475 nm; emission maximum = 505 nm.) The coding sequence of the AcGFP1 gene contains silent base changes, which correspond to human codon-usage preferences .

       pAcGFP1-1 is a promoterless vector that can be used to monitor transcription from different promoters and promoter/enhancer combinations inserted into the multiple cloning site (MCS). Sequences upstream of AcGFP1 have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (2) to enhance translation effciency in eukaryotic cells. SV40 polyadenylation signals downstream of the AcGFP1 gene direct proper processing of the 3' end of the AcGFP1 mRNA. The vector backbone contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T antigen, a pUC origin of replication for propagation in E. coli, and an f1 origin for single-stranded DNA production. A neomycin-resistance cassette (Neor) allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. This cassette consists of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene. A bacterial promoter upstream of the cassette expresses kanamycin resistance in E. coli.

质粒图谱

pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。