R6K-Box大肠敲除质粒
基本信息
原核抗性: 卡那霉素Kan
克隆菌株: SM10(λpir)
培养条件: 37℃
质粒简介
Red重组一定会有一个通过PCR制备线性的打靶盒子(box)的过程。此质粒是Ori R6K控制复制,只在SM10(λpir)的大肠杆菌中复制。故用此质粒为模板构建打靶盒子,不会产生假阳性。此质粒包含lox71-KanR-lox66结构。
质粒图谱![R6K-Box.png R6K-Box.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/63d4068d-5494-48d9-b1f7-38ee2c824403.jpg)
R6K-Box大肠敲除质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
R6K-Box大肠敲除质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。
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