5’RACE试剂盒
英文名称:
运输:低温
保存:负20℃
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品及特点
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录起始位点,目前最通用的方
法是 5′-RACE 法,RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是 Frohman
发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术,它在不建立 cDNA 文库的前提下,
利用已知 cDNA 序列设计引物,通过往两端延伸和扩增获得其 5′-端序列。本试剂盒
就是根据 5′-RACE 原理而开发,它具有下列特点:
1. 即开即用,客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化,包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。
自备试剂 Poly(A) RNA(或总 RNA)、基因专一性引物 A、B、C、75%乙醇。注意:自备的
基因专一性引物 A,B,C 的相对位置必须跟本手册产品介绍中的示意图一致。
运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。
使用方法 1. 变性模板 RNA:将 1 μg mRNA 或 5 μg 总 RNA 加入到一个 RNase-free 的
塑料管中,补 RNase-Free 水到 10 μL,65℃保温 5 分钟后短暂离心,立即放
冰上待用。如果 RNA 浓度偏低,加 RNase-Free 水之前体积就已超过 10μL,
则需要使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,编号为 110801)浓缩到所需的体积。
2. 在塑料管中按顺序加入:
成分 用量
自备的基因专一性引物A(10 μM) 2 μL
MMLV Buffer-dNTP混合液 6 μL
MMLV逆转录酶-RI混合液 2 μL
3. 37℃保温 60 分钟, 42℃保温 30 分钟, 50℃保温 10 分钟,最后 75℃保温
10 分钟使逆转录酶变性。短暂离心 5 秒后待用。
4. 在塑料管中加入 40μL 微量核酸沉淀剂(含不溶的核酸助沉剂,用前需要充分
摇匀再取用),震荡混匀。
5. 室温 12000 rpm 离心 15 分钟,沉淀即为 cDNA。小心吸弃上清。此步沉淀可
以去除多余的 dNTP,否则它们会干扰下步的 TdT 加尾反应。
6. 加入 1mL 自备 75%乙醇,室温 12000 rpm 离心 5 分钟,小心吸弃上清。此
步可以洗去逆转录反应中的盐离子。
7. 短暂离心数秒,小心吸弃残留液体后,晾干后加入 20 μL RNase-free 水,充
分吹打溶解 cDNA 沉淀。注意:为保证加尾效率,溶解 cDNA 的 RNase-free
水最好不要超过 20 μL。
8. 在两个塑料离心管中按下表设置加尾反应:
成分 样品管 加尾阴性对照管
cDNA溶液(上步所得) 9 μL 9 μL
2×TdT Buffer(含dATP) 10 μL 10 μL
RNase-Free水 - 1 μL
TdT酶 1 μL -(用1μL水代)
9. 37℃保温 15 分钟进行加尾反应,然后 75℃保温 3 分钟灭活末端转移酶。
在反应管中分别加入 0.5 mL RNase-free 水稀释样品和阴性对照。此 250 倍稀
释液将作为下步 PCR 的模板。
10. 第一轮 PCR:按下表分别使用不同体积的样品稀释液和阴性对照稀释液做模板
设置 50uL 的 PCR 反应(单位:μL,下表只列出以样品稀释液为模板的反应)。
成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4
PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25
自备基因专一性引物 B(10 μM) 2.5 2.5 2.5 2.5
5′ RACE 引物 A-引物 B 混合液 2.5 2.5 2.5 2.5
样品管稀释液 1 5 10 15
RNase-free 水 19 15 10 5
11. 按下列条件进行 PCR(注:应根据自备引物的 Tm 值选择适当的退火温度,下
面的参数仅仅供参考)。
第 1 次循环:94℃ 5 分,48-52℃ 2 分,72℃ 4 分
第 2-30 次循环:94℃ 40 秒,52-60℃ 1 分,72℃ 3 分
最后延伸:72℃ 15 分
12. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳(不需要上样液)检查 PCR 结果(样品
组 4 个样,阴性对照组 4 个样)。如果样品有一条清晰的扩增条带,而阴性对照
在相应的位置没有扩增产物,则可以不做后续的第二轮 PCR,直接进行 DNA
测序或切胶克隆。如样品没有一条清晰的扩增条带,则进入第二轮 PCR。
13. 第二轮 PCR:从 8 管 PCR 产物中各取 1μL 分别加入到 20 μL RNase-free 水
中进行稀释 20 倍,再各取 1 μL 分别作为第二轮 PCR 的模板,共 8 个反应:
成分 用量
第一轮 PCR 产物的 20 倍稀释液 1 μL
PCR MagicMix 3.0 25 μL
5′ RACE 引物 C 2.5 μL
自备基因专一性引物 C(10 μM) 2.5 μL
RNase-free 水 补至 50 μL
14. 按下列条件进行 PCR:第 1-30 次循环(94℃ 40 秒,52-60℃ 1 分,72℃ 3
分),最后延伸:72℃ 15 分
15. 直接取 20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳(不需要上样液),一般都会有一个样品
有清晰的条带出现,则可以直接进行 DNA 测序或 TA 克隆。
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