DNA快速连接试剂盒

DNA快速连接试剂盒

英文名称：Rapid DNA Ligation Kit

运输：低温

保存：负20度

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

产品及特点

 DNA 连接反应通过 T4 连接酶催化双链 DNA 的 3'-OH 和 5'-P 形成磷

酸二脂键而将 DNA共价连接在一起。被连接的 DNA末端可以是粘末端（例

如限制性切割 EcoR I 产生的末端），也可以是平末端（限制性切割 Sma I

产生的末端）。Pheiffer 等人发现 PEG 可以促进 T4 DNA 连接酶催化的

连接反应[NAR, 11, 7853-7871, 1983]，连接反应只需十分钟即可完成。

本产品就是根据这一原理设计，其特点如下：

1. 超快，整个连接反应只需要室温 5 分钟左右，反应液可以直接用于转

化实验。

2. 高效，溶液配方经过优化，每 ug 插入 DNA 连接转化得到的重组子可

达 107 左右。

3. 既可用于平末端连接，也可用于粘末端连接，包括 PCR 产物与 T 载

体的连接。

4. 简单，客户只需要提供载体和插入片段即可。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法 一: 连接反应

1. 在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分（以 10 uL 体系为

例）:

成分 阴性对照管 样品管

溶液 A 5 uL 5 uL

插入片段（自备） - 0.2-0.5 ug(注)

载体（自备） 50 ng 50 ng

无菌水 补水到 9 uL 补水到 9 uL

注: 插入 DNA 片段的摩尔数最好是载体的 3-10 倍，如果载体长度

为 3000bp，则所需插入 DNA 片段折合成重量(ng) ＝ (插入 DNA

片段 bp 数×50 ng×N)÷3000 bp。N 就是自己选定的插入 DNA

片段与载体的摩尔比。

2. 最后在每管中加入 1 uL 溶液 B，轻柔吹打混合均匀后用微量离心机

将液体全部甩到管底。

3. 室温放置至少 5 分钟，最长可以放置过夜。

4. 70℃保温 10 分钟。此步可以灭活有关的酶，否则转化效率有所降低。

5. 根据使用的转化方法，每管各取适量用于转化实验，余下的放置在

-20℃保存。

二：细菌转化及筛选（仅供参考，本产品不提供相关试剂）

6. 将 100 μL 转化效率在 1×108 cfu/μg 以上的感受态细胞于冰上解

冻。

7. 取 5-10 μL 连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀。

8. 在冰上放置 30 分钟。

9. 将离心管放 42℃热休克 90 秒，然后快速将其转移到冰浴中放置 1~2

分钟。

10. 每管中加 900 μL LB 培养基，37℃振荡培养 1 小时复苏细胞。

11. 将 100 uL 复苏涂布到含 Amp 的 LB 琼脂平板上（根据载体情况也

可能需要加上 X-gal 和 IPTG）。

12. 室温 4,000 rpm 离心剩余的 900 uL 复苏细胞 5 分钟，弃去 800 μ

L 上清，用剩余 100 μL 培养基重悬细胞并涂布到含 Amp 的 LB 琼脂

平板上（可加 X-gal、IPTG）。

13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在

37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。

14. 倒置平皿，于 37℃培养，12~16 小时后可出现菌落。一般情况下阳

性对照组会有上千个菌落（100 uL 转化液产生的菌落数×10），自 联

对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于 PCR 回收片段的质

量。

15. 按常规方法筛选重组子。