DNA磷酸化试剂盒
英文名称:DNA Phosphorylating Kit
运输:低温
保存:负20度
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品及特点
人工合成的 PCR 引物、linker 和 adaptor 的 5′端一般都是-OH 基团而不是-PO4 基团(除非额外付费要求在人工合成时加上-PO4 基团),而任何 DNA 连接酶
都不能将一个 DNA 分子 5′端的-OH 基团和另一个 DNA 分子 3′端的-OH 基团
进行连接,因此通过人工合成的 DNA 片段和天然 DNA 之间的连接效率一般都比天
然 DNA 彼此的连接效率低(天然 DNA 4 个端口均可连接,人工合成的 DNA 跟天
然 DNA 有 2 个端口可以连接,人工合成的 DNA 之间没有任何端口可以连接),尤
其是在平末端连接时。本公司开发的 DNA 磷酸化产品能将 DNA 分子 5′端的-OH
基团磷酸化。它具有下列特点:
1. 可以快速把 DNA 5′端的-OH 基团变成-PO4 基团,使人工合成的 DNA(包括
PCR 产物)跟天然 DNA 一样有高的连接效率。
2. 既可以对单链 DNA 进行磷酸化处理,也可以对双链 DNA 片段同时磷酸化处理。
3. 处理后的 DNA 可以直接用于连接反应、克隆等,不需要纯化。
4. 本产品足够 20 次 DNA 的磷酸化实验。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期为 6 个月。
自备试剂 引物、PCR 产物、DNA 片段
使用方法 一:双链 DNA 片段(5’端为-OH 基团的)的磷酸化
注意:如果是 PCR 产物,一定要先胶回收,不能使用没经过纯化的 PCR 反应液,
因为其中的残留 PCR 引物会耗掉大量的激酶,降低 PCR 产物的磷酸化效率。
1、在微量离心管中配制下列反应液(20μL):
成 分 用 量
PCR 胶回收片段 2 μL(不超过 10 pmol)
10×TPK 缓冲液 2 μL
ATP 溶液(10 mM) 5 μL
T4 多核苷酸激酶(10U/uL) 1 μL
超纯水到 20 μL
2、37℃反应 30 分钟。
3、70℃热处理 5 分钟,灭活酶。
4、可直接用于后续克隆(加入量不要超过总体积的 1/5)。
二:单链 DNA 片段的磷酸化
注:单链 DNA 包括局部双链的 DNA。引物,linker,adaptor,Oligo 探针等均按
此操作处理。
5、在微量离心管中配制下列反应液(20μL):
成 分 用 量
单链 DNA 片段 5-10 pmol
10×TPK 缓冲液 2 μL
ATP 溶液(10 mM) 1 μL
T4 多核苷酸激酶(10U/uL) 1 μL
超纯水到 20 μL
6、37℃反应 30 分钟。
7、70℃热处理 5 分钟,灭活激酶。
8、可直接用于后续克隆(加入量不要超过总体积的 1/5)。如果使用浓度高,则可
能需要乙醇沉淀法浓缩 DNA。如果单链 DNA 的浓度低于 5pmol,还需要在乙
醇沉淀时加入核酸助沉剂。沉淀得到的 DNA 可溶解在适量的水中。
附:乙醇沉淀浓度 DNA(本试剂盒不提供相关试剂,下列操作仅供参考_:
1、在 DNA 溶液中加入 0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠溶液(pH 5.2),
2、再加入 2.5 倍体积的无水乙醇和 4uL 核酸助沉剂。
3、混匀后 12000g 4℃离心 10 分钟,小心弃上清。
4、加入 1mL 70%乙醇,短暂离心 3 分钟后小心弃上清。
5、短暂离心 5 秒,吸弃残留液体(约 30-50uL)。
6、室温放置 2 分钟干燥后加入适量的超纯水溶解 DNA,立即使用或放-20℃长期
保存
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