图1 在检测和研究中可能面临的问题与选择
对病毒基因组进行高通量测序,可以采取宏基因组测序或靶向测序(包括探针捕获测序和多重PCR扩增子测序)。不同的方法各有优势,可根据实际应用进行选择。
图2 不同高通量测序方法的比较
3. 如只需针对目的病毒进行检测,希望以较少的数据量获得目的病毒全长序列,可以选择靶向测序。
关于测序数据量,需结合具体的测序目的、测序方法、样本病毒载量等因素进行综合评估。通常,提高测序数据量,可以提高检测灵敏度,改善临床检测的阳性率。另外,提高测序数据量,可以提高数据覆盖度,病毒序列组装效果更好。以满足病毒基因组覆盖度>95%,且单碱基深度>10x为条件:
如采用宏基因组测序,可根据使用的研究材料(即待检样本)的情况,选择测序数据量。
病毒载量在104 copies/ml以上或qPCR定量CT值<24.5的样本,推荐数据量为20Gb(PE100,100M reads);
qPCR定量CT值在24.5~28.7范围的样本,推荐数据量为100Gb(PE100,500M reads)。
对于病毒载量极低的样本(CT值>28.7),不建议使用宏基因组测序,可以采用多重PCR扩增子测序。
如采用多重PCR扩增子测序,推荐数据量为5-20M。该方法也适用于病毒载量极低(<102copies/ml)的极端样本检测。
注:推荐样本数据量仅供参考
图3 基于测序方法及样本病毒载量的测序数据量选择
图4 测序读长选择
针对病毒RNA测序,在文库制备过程中是否去除核糖体RNA(rRNA)也是一个值得探讨的问题。rRNA占总RNA的80%以上,去除人类rRNA可以提高有效数据利用率。同时也需要考虑样本情况:如果病毒核酸投入量低,以及放置时间久、降解严重的样本,去除rRNA可能会影响建库效果,可以选择不去rRNA,以提高建库成功率。
图5 MGIEasy rRNA去除试剂盒
根据实验室样本规模,选择合适的测序平台。每个平台单次运行的样本数与测序方法、测序数据量相关。其中,宏基因组测序方法,一般以单个样本的数据通量>100M reads为参考;多重PCR扩增子测序方法,以单个样本的数据通量>5M reads为参考。
注1.以单个样本的数据通量>100M reads为例;
注2.以单个样本的数据通量>5M reads为例。
图6 测序平台单次运行的样本数估算
基于DNBSEQ平台的已发表文章
目前,已有多篇基于DNBSEQ平台的新冠科研文章在Lancet、nature、Cell等顶级期刊获发。基于DNBSEQ平台的高通量测序技术助力新冠病毒科研攻关,得到了越来越多科研学者的认可。
参考文献
Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19(SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples.
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