干货| 我们要如何妥善保存病毒这个小东西

病毒是具有生物活性的最小微生物，由于其结构复杂，各种类型的病毒对物理、化学作用的反应有所不同（温度、ph、盐类等）。保存病毒首先必须了解各种病毒的性质，才能恰当的选择保存剂和保护方法。来源：《病毒学检验》

目前的病毒保存方式分为两种：冷冻干燥保存；低温及超低温保存

首先我们来看一下冷冻干燥保存。

一、实验方法原理

含水物质首先经过冷冻，然后在真空中使水分升华，干燥，在这种低温、干燥和缺氧环境下，微生物的生长和代谢暂时停止，因而保存期较长，便于运输。该法需要冻干机等设备，并需保护剂。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用机理是在冷冻干燥的脱水过程中稳定病毒结构，防止细胞膜受冷冻或干燥而造成损伤。真空冻干病毒比较稳定，可于室温短期保存， 4~8℃长期保存。此法综合利用了各种有利于毒种保存的因素，具有成活率高，变异性小等优点，是常用的较理想的毒种保存方法之一。

二、实验材料

待保存的病毒样本

三、试剂、试剂盒

保护剂，95% 乙醇

四、仪器、耗材

1、安瓿瓶 

        美国wheaton提供的安瓿瓶均由硼硅玻璃制造，符合uspⅰ型以及astm e 438ⅰ型标准，a 类要求，可用于液氮蒸汽冷凝, 特殊的设计允许低温储存和快速解冻。容量1-50ml，顶封口或拉颈部拉伸封口。其中wheaton vacule安瓿瓶专门适用于冷冻干燥机，容量2ml，用于小容积冻干样品。

 
2、真空泵

        WIGGENS 旋片式油封真空泵广泛应用于真空蒸馏、真空抽滤、真空探伤、真空冷冻干燥、真空镀膜、真空检漏、真空包装、真空吸附等行业。最低真空度可达4×10^-4mbar。

五、实验步骤

1. 准备安瓿管。市售的安瓿有直管式的，也有底部为球形的球式安瓿，也可选用中性硬质玻璃自制安瓿管。安瓿管清洁后，将标有病毒的标签放人安瓿管内，高压灭菌后备用。

2. 制备保护剂。冻于菌种的保护剂种类很多，常用脱脂牛奶，可配成 20%乳液，分装，高压灭菌，并作无菌试验。

3. 制备病毒悬液。吸取 3 ml 无菌牛奶加入毒种，轻轻摇动，再用手搓动试管，制成均匀的病毒悬液。

4. 分装及预冻。用无菌的长颈滴管将病毒悬液分装于安瓬管底部，每管装 0. 2 ml 。将安瓬管上端烧熔成细颈，将安瓬整个浸入装有干冰和 95% 乙醇的预冻槽内，槽内温度约为- 50℃~- 40℃, 可使悬液冻结成固体。

5. 真空干燥。完成预冻后，开动真空泵抽气，气压降至 133. 3 kpa 以下，维持冻结剂可于 4 h后移去，继续于室温中抽气，达到完全干燥。

6. 封管。待毒种完全干燥后即从干燥缸内取出安瓿瓶，置于抽气管上抽成真空，约需 3~10 min。用高频真空检测仪检查后，置 4℃冰箱保存。

六、注意事项

1. 一般病毒应保藏于低温、清洁和干燥的地方。

2. 毒种操作必须在无菌条件下进行，防止污染。

3. 对于已发生变异的病毒，可通过接种易感动物将具有毒力的病毒重新选择出来，该法还可同时使一些表型变异的病毒恢复原有特性。

4. 实验室用培养基保存毒种时，应保存两套，一套供保存传代，另一套供日常应用。

5. 病毒株的保存需有专人负责，同时有专门的记录薄，记录的内容有：①毒株的名称及数量；②毒株的来源（研究室名、时间、毒株从何种材料上分离、传代于何种动物、传代数、分离情况等）；③本实验室传代的情况（传代者姓名，传代的代数，传代后的保存方法及保存数量）④保存毒种的容器（安瓶、玻璃试管、塑料冻存管等）；⑤毒株的保存性质（组织块、悬液、液体或冻干）；⑥毒株的毒力；⑦保存年、月、日。

接下来我们来看一下另外一种保存方式——低温及超低温保存。

一、实验方法原理

是适用范围最广的微生物保存法，也是目前保存病毒较理想的方法。低温条件可降低病毒变异率和长期保持原种的性状。温度越低，保存时间越长。这种方法需要加保护剂，常用的保护剂为脱脂牛奶溶液、 5%蔗糖、血清等。

二、实验材料

待保存的病毒样本

三、试剂、试剂盒

保护剂

四、仪器、耗材

1、低温(-60~- 25℃)超低温(- 70℃以下）冰箱

2、液氮罐（-196~ -150℃)

出于人员和病毒样本的安全性，以及后期病毒样本的管理以及可追溯的考虑，除了目前传统的液氮罐储存方式，另外还可以使用自动化液氮罐系统用于病毒样本保存。

美国brooks的自动化液氮罐系统能够为样本提供-190℃以下存储环境，能够保持样本操作的全程不间断冷冻链，使样本始终保持在-135℃以下。可存储和管理用户数据，包括但不限于用户角色，群组和访问功能的控制；具备监控，追踪以及控制样本库存的功能；系统可自动审核盘点冻存架存储状态。

五、实验步骤

用保护剂配制病毒悬液，无菌分装（参照冷冻干燥保存的前面步骤），然后置低温冰箱或液氮罐中保存。

六、注意事项

1. 一般病毒应保藏于低温、清洁和干燥的地方。

2. 毒种操作必须在无菌条件下进行，防止污染。

3. 对于已发生变异的病毒，可通过接种易感动物将具有毒力的病毒重新选择出来，该法还可同时使一些表型变异的病毒恢复原有特性。

4. 实验室用培养基保存毒种时，应保存两套，一套供保存传代，另一套供日常应用。

5. 病毒株的保存需有专人负责，同时有专门的记录薄，记录的内容有：①毒株的名称及数量；②毒株的来源（研究室名、时间、毒株从何种材料上分离、传代于何种动物、传代数、分离情况等）；③本实验室传代的情况（传代者姓名，传代的代数，传代后的保存方法及保存数量）④保存毒种的容器（安瓶、玻璃试管、塑料冻存管等）；⑤毒株的保存性质（组织块、悬液、液体或冻干）；⑥毒株的毒力；⑦保存年、月、日。